一种用于人间充质干细胞的无血清培养基及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，包括基础培养基、MCDB、胰岛素铁硒传递蛋白、人血清白蛋白、青链霉素以及地塞米松；所述基础培养基为DMEM培养基。本发明专利技术还公开了其用于人间充质干细胞的分离、纯化培养方法。本发明专利技术的无血清培养基可提高间充质干细胞的分离和纯化效果，以该无血清培养基为基础加入亚油酸、人源AB型血清、血小板衍生生长因子、表皮细胞生长因子用于扩增培养时，可保持间充质干细胞的原始性，避免了分化，从而保证了人间充质干细胞的安全性，提高了细胞的扩增速度，减少了扩增时间，降低了成本。

Serum free medium for human mesenchymal stem cells and uses thereof

The invention discloses a serum-free medium for human mesenchymal stem cells, including basal medium, MCDB, insulin transferrin selenium, human serum albumin, penicillin and streptomycin and dexamethasone; the basic medium was DMEM. The invention also discloses a method for separating, purifying and culturing human mesenchymal stem cells. Serum free medium can improve the mesenchymal stem cell isolation and purification effect of the invention, the serum free medium for added linoleic acid, human AB type serum, platelet-derived growth factor and epidermal growth factor for cultured, can keep the original mesenchymal stem cells, to avoid in order to ensure the safety of the differentiation of human mesenchymal stem cells, improve the amplification rate of cells, reduce the amplification time, reduce the cost.

【技术实现步骤摘要】
一种用于人间充质干细胞的无血清培养基及其应用
本专利技术属于干细胞培养
，具体涉及一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，本专利技术还涉及利用该培养基分离、纯化培养人间质干细胞的方法。
技术介绍
细胞治疗己成为生物治疗领域中最活跃的一个部分，规范化的细胞治疗研究已成为现代医学的重要组成。当前我国细胞治疗中常用的细胞类型是成体来源的细胞，如免疫细胞、骨髓干细胞、脐血和脐带来源的造血或间充质干细胞等。间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)来源广泛，也较易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性低，无道德伦理问题的限制，所以在免疫治疗和基因治疗方面有着巨大的应用前景。如自体或异基因骨髓或脐血造血干细胞移植用于治疗血液病、恶性肿瘤等；或骨髓和脐带来源的间充质干细胞经移植后转化为肝样细胞、成骨细胞、心肌细胞、汗腺细胞等。目前，用于间充质干细胞的分离、纯化培养的培养基主要是在基础培养基的基本上添加一定浓度的动物血清如胎牛血清（FBS），动物血清含有异种蛋白质，使用动物血清培养和扩增的自体间充质干细胞在用于临床治疗时，可致受者体内产生抗体，从而引起免疫反应。因此，不含血清的培养基成为人们研究的热点。如中国专利“一种间充质干细胞无血清培养基”（申请号为201110420539.9，公告号为CN102433302A）公开了一种主要由碱性成纤维细胞生长因子、人表皮细胞生长因子、重组人胰岛素、人血白蛋白、亚硒酸钠、左旋卡尼丁和白藜芦醇等组分组成的培养基，该培养基不含血清，含有多种生长因子，并且通过加入左旋卡尼丁和白藜芦醇可有效改善间充质干细胞生长状态。但是，该无血清培养基只能将脐带间充质干细胞数目扩增大约1000倍，其专利说明书中也只提及了使用该培养基用于脐带间充质干细胞最多经过10次传代培养时，能够保证脐带间充质干细胞的生物学特性不变。与上例相同，目前可见的间充质干细胞无血清培养培养技术普遍存在着培养成本高、扩增数量有限[扩增数量一般可在(1-2)×108]、扩增时间长、干细胞易分化等不足，直接影响临床应用的安全性。保持人间充质干细胞的干性（即原始未分化性），并大量扩增，从而应用于临床研究是细胞治疗研究的重要内容之一。但是为能够实现该方法的临床有效应用，对该人间充质干细胞的有效的规模化培养并保持其干性则成为了主要难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于分离、纯化培养人间充质干细胞的无血清培养基，该无血清培养基能提高人间充质干细胞的分离纯化效率，以该无血清培养基为基础加入亚油酸（LA）、人源AB型血清、血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮细胞生长因子（EGF）用于人间充质干细胞扩增培养时，可提高扩增速度、减少扩增时间，并能始终保持干细胞的干性。本专利技术所采用的技术方案如下：一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基组分包括基础培养基、MCDB、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）、人血清白蛋白（HSA）、青链霉素（Pen/strep）以及地塞米松（DEX）；所述基础培养基为DMEM培养基。上述无血清培养基以1升计算，各组分的用量如下：MCDB20~100ml、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）50~400μl、人血清白蛋白（HSA）50~100μl、青链霉素（Pen/strep）0.5~2ml、地塞米松（DEX）5~20μl、余下为基础培养基。进一步地，上述无血清培养基以1升计算，各组分的用量优选为：MCDB50ml、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）200μl、人血清白蛋白（HSA）60μl、青链霉素（Pen/strep）1ml、地塞米松（DEX）10μl、余下为基础培养基。本专利技术用于人间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：1）人间充质干细胞原代分离培养自人脐带分离出人间充质干细胞后，或自骨髓血或脐带血分离出单个核细胞后，于上述组分的无血清培养基中进行分离纯化培养；2）扩增多次传代培养将步骤1）原代分离培养得到的间充质干细胞，于如下组分的扩增培养基进行扩增传代培养：MCDB20~100ml、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）50~400μl、人血清白蛋白（HSA）50~100μl、青链霉素（Pen/strep）0.5~2ml、地塞米松（DEX）5~20μl、亚油酸（LA）1~10ml、人源AB型血清1~10ml、血小板衍生生长因子（PDGF）10~100μl、表皮细胞生长因子（EGF）50~100μl、加基础培养基至1升。在上述技术方案的基础上，上述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养为自人脐带分离人间充质干细胞，釆用贴壁法，包括如下步骤：1）将剪碎的间距在0.2~0.5cm的脐带小块均匀平铺在培养皿中；翻转培养瓶置37℃4~6h；2）4~6h后正置培养瓶，培养12h过夜；3)7~10天时观察细胞爬出情况，换液1~2次将组织块弃去，补足培养基继续培养至可传代。上述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养为自人脐带分离人间充质干细胞，釆用酶消化法，包括如下步骤：1）将剪碎的脐带装入血清瓶中，加Ⅱ型胶原酶2ml、PBS2ml，混匀后封口，置37℃过夜，过夜期间每隔2~6混匀；2）次日，取消化好的组织块，取上清移置于新管；3）加1ml0.25%胰酶，置37℃消化5min；4）加1ml培养干细胞培养基终止消化，补PBS至10ml；5）3000~4000rpm离心10min；6）弃去上清，加1ml培养干细胞培养基重悬沉淀，接种到培养皿/瓶，补足培养基培养；7）每两天观察，每3天半量更换培养基，培养至可传代。另外，上述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养也可为脐带华通氏胶来源的间充质干细胞的分离培养，可釆用上述的贴壁法或酶消化法。上述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养为自骨髓血或脐带血分离单个核细胞，釆用梯度离心法，包括如下步骤：1）采集人骨髓血或健康脐带血50ml，利用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞；2）置于培养干细胞培养基，调整细胞浓度为3×106/mL，37℃、5％CO2孵育24小时后收集贴壁细胞即得到分离纯化的间充质干细胞。与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果如下：本专利技术的无血清培养基可提高间充质干细胞的分离和纯化效果，以该无血清培养基为基础加入亚油酸（LA）、人源AB型血清、血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮细胞生长因子（EGF）用于人间充质干细胞扩增培养时，可保持间充质干细胞的原始性，避免了分化，从而保证了人间充质干细胞的安全性，提高了细胞的扩增速度，减少了扩增时间，降低了成本。流式结果显示，即使传代30代，人间充质干细胞的形态仍均一。本专利技术的无血清培养基可用于自体骨髓血、脐带血或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞的分离纯化处理，通过加入LA、人源AB型血清、PDGF和EGF用于扩增培养时，可保证扩增的原始性，从而提高了该三种来源的人间充质干细胞对相关疾病的治疗作用。附图说明图1为分离第7天的原代脐带华通氏胶来源间充质干细胞的形态结构图；图2为培养第7天的自体骨髓血来源的原代间充质干细胞的形态结构图；图3为培养第7天的脐带血来源的原代间充质干细胞的形态结构图；图4为培养第60代的人间充质干细胞的形态结构图；图5为第2代的CD29、CD45的流式细胞鉴定图；图6为第2代的的CD34、C44本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基组分包括基础培养基、MCDB、胰岛素铁硒传递蛋白、人血清白蛋白、青链霉素以及地塞米松；所述基础培养基为DMEM培养基。

【技术特征摘要】
1.一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基组分包括基础培养基、MCDB、胰岛素铁硒传递蛋白、人血清白蛋白、青链霉素以及地塞米松；所述基础培养基为DMEM培养基。2.如权利要求1所述的一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基以1升计算，各组分的用量如下：MCDB20~100ml胰岛素铁硒传递蛋白50~400μl人血清白蛋白50~100μl青链霉素0.5~2ml地塞米松5~20μl余下为基础培养基。3.如权利要求1所述的一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基以1升计算，各组分的用量如下：MCDB50ml胰岛素铁硒传递蛋白200μl人血清白蛋白60μl青链霉素1ml地塞米松10μl余下为基础培养基。4.一种将权利要求1至3任一项所述无血清培养基的应用，其特征在于，包括如下步骤：1）人间充质干细胞原代分离培养自人脐带分离出人间充质干细胞后，或自骨髓血或脐带血分离出单个核细胞后，于如下组分的培养基中进行分离纯化培养：MCDB20~100ml胰岛素铁硒传递蛋白50~400μl人血清白蛋白50~100μl青链霉素0.5~2ml地塞米松5~20μl余下为基础培养基；2）扩增多次传代培养将步骤1）原代分离培养得到的间充质干细胞，于如下组分的扩增培养基进行扩增传代培养：MCDB20~100ml胰岛素铁硒传递蛋白50~400μl人血清白蛋白50~100μl青链霉素0.5~2ml地塞米松5~20μl亚油酸1~10ml人源AB型血清1~10ml血小板衍生生长因子10~100μl表皮细胞生长因子...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘力伟，刘波，
申请(专利权)人：刘力伟，
类型：发明
国别省市：安徽,34