一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法技术

本发明专利技术涉及干细胞领域，公开了一种制备干细胞外泌体冻干粉的方法，尤其是一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法。本发明专利技术所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，以海藻糖作冷冻保护剂与人羊膜间充质干细胞外泌体混合，滤膜过滤除菌，先经超低温预冻后再在一定真空度下低温冷冻。本发明专利技术所述制备方法操作简单、安全有效。实验表明，与常规冻干粉制备方法相比，本发明专利技术所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法能很好保持人羊膜间充质干细胞外泌体的形态和活性，适用于冻存人羊膜间充质干细胞外泌体的长期保存及应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及干细胞领域，公开了一种制备干细胞外泌体冻干粉的方法，尤其是。本专利技术所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，以海藻糖作冷冻保护剂与人羊膜间充质干细胞外泌体混合，滤膜过滤除菌，先经超低温预冻后再在一定真空度下低温冷冻。本专利技术所述制备方法操作简单、安全有效。实验表明，与常规冻干粉制备方法相比，本专利技术所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法能很好保持人羊膜间充质干细胞外泌体的形态和活性，适用于冻存人羊膜间充质干细胞外泌体的长期保存及应用。【专利说明】_种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法
本专利技术涉及干细胞领域，具体涉及一种制备干细胞外泌体冻干粉的方法，尤其是 。
技术介绍
外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的大小均 一，直径为40?100nm，密度1. 10?I. 18g/ml的囊泡样小体。外泌体的应用主要集中在临 床诊断及抗肿瘤方面。 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我更新和多向分化 能力的细胞，产生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生 医学领域有重要作用。Lai等通过质谱技术分析发现：MSCs的外泌体中含有丙酮酸激酶 (pyruvate kinase，PK)人乳脂肪球EGF 因子蛋白（milkfat globule_EGFfactor8protein， MFGE8)及跨膜四蛋白等857种蛋白质，它们参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织的 修复与再生。许多的研宄表明MSCs外泌体在治疗组织损伤性疾病中具有重要的作用。人 胎盘羊膜组织中含有丰富的间充质干细胞，所获得的人羊膜间充质干细胞（humanamniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)可以在体外条件下稳定培养，细胞活性强，分泌旺盛，其 细胞培养上清液中含有大量的外泌体。同时，所分泌的外泌体来源单一稳定。 目前，常用的提取外泌体的方法有：离心法，免疫磁珠法，过滤离心法，密地梯度离 心法等。但想保持外泌体的活性，提取过程不添加其他来源物质以及操作简便方面考虑，离 心法仍然是最常用的方式。所提纯的外泌体目前主要的储存方式为把悬液冰冻保存（_20°C 到-80°C ) 现有的技术中，外泌体的来源不稳定，多来源于血液等体液或各种来源的细胞，不 能使产品质量稳定可控。另外，由于外泌体需要冷冻保存，这使其在储存，运输及应用方面 带来了许多不便。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种操作简单、安全有 效，同时又能很好保持外泌体活性的制备外泌体冻干粉方法，用于冻存人羊膜间充质干细 胞外泌体。 为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案： ，取人羊膜间充质干细胞外泌 体，加入海藻糖混匀后，滤膜过滤，分装后超低温冷冻12h，然后在IOPa的真空度、-50°c的 条件下冷冻12h?48h。 在一些实施方案中，所述海藻糖的加入量为至海藻糖终浓度为IOwt%。 在一些实施方案中，所述滤膜孔径为〇. 22 μ m。 在一些实施方案中，所述超低温为-80°C。 在一些实施方案中，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方法为在4°C下，人羊 膜间充质干细胞培养上清在300g?IOOOOg的离心力下离心去除培养上清中的细胞及细胞 碎片，收集上清，在IOOOOOg的离心力下离心去除培养基中蛋白质收集沉淀获得人羊膜间 充质干细胞的外泌体。 进一步，在一些优选实施方案中，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方法具 体包括以下步骤： (1)、培养上清300g离心lOmin，收集上清液，弃沉淀； (2)、上清液2000g?3000g离心20min?30min，收集上清液，弃沉淀； (3)、上清液IOOOOg离心60min?lOOmin，收集上清液，弃沉淀； (4)、上清液IOOOOOg离心60min?120min，弃上清，收集沉淀； (5)、沉淀加入PBS重悬后，IOOOOOg离心60min?120min弃上清，收集沉淀。 在一个具体实施例中，本专利技术采用原子力显微镜对本专利技术所述制备方法制备得到 的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体 进行形态学观察，结果显示采用本专利技术所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌 体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体的形态大小相似，没有显著性 差异。 在一个具体实施例中，本专利技术采用CCK-8法检测本专利技术所述制备方法制备得到的 人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体增 殖能力，结果显示，本专利技术所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复 溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体对细胞的增殖均有促进作用，且效果没有 显著性差异。 进一步的，在一个具体实施例中，本专利技术采用免疫印迹法分析本专利技术所述制备方 法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融 化的外泌体CD63及CD9的表达，结果显示本专利技术所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干 细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体仍然为外泌体，有⑶63及⑶9的表达。 由此可见，采用本专利技术所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法制备人 羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉能够很好保持外泌体的形态及活性。 本专利技术还提供了所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉。 在一个具体实施例中，本专利技术比较本专利技术所述制备方法与常规的冻干方法对制备 人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的影响，形态鉴定结果显示添加 i〇wt%海藻糖制备的人 羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体，大小均匀，外泌体的尺寸也没有明显的 改变。而添加10wt%葡萄糖及不添加其他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复 溶后的外泌体体积变大，大小不均匀。活性检测结果显示添加 l〇wt%海藻糖制备的人羊膜 间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体活性明显优于添加 l〇wt%葡萄糖及不添加其 他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体活性。表明本专利技术所述制 备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法明显优于现有的冻干方法。 本专利技术所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，以海藻糖作冷冻保护 剂与人羊膜间充质干细胞外泌体混合，滤膜过滤除菌，先经超低温预冻后再在一定真空度 下低温冷冻。本专利技术所述制备方法操作简单、安全有效。实验表明，与常规冻干粉制备方法 相比，本专利技术所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法能很好保持人羊膜间充质 干细胞外泌体的形态和活性，适用于冻存人羊膜间充质干细胞外泌体的长期保存及应用。 【专利附图】【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 图1示实施例1用于收集培养上清的细胞状态图，其中a放大倍数为40倍，b放 大倍数为100倍； 图2示实施例3用原子力显微镜对人羊膜间充质干细胞外泌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，取人羊膜间充质干细胞外泌体，加入海藻糖混匀后，滤膜过滤，分装后超低温冷冻12h，然后在10Pa的真空度、‑50℃的条件下冷冻12h～48h。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，麦锦连，马岩岩，王小燕，舒辉萍，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44