一种人羊膜间充质干细胞分离培养方法技术

本发明专利技术提供了一种人羊膜间充质干细胞分离培养方法。本发明专利技术方法中，通过将人羊膜间充质干细胞从胎盘组织上分离、提取并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到人羊膜间充质干细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞提取培养领域，具体而言，涉及一种人羊膜间充质干细胞分离培养方法。
技术介绍
糖尿病是一种常见的由内分泌系统代谢障碍引起的慢性终身疾病，长期患病可导致神经系统、心血管系统、泌尿系统等多种系统的慢性损害。随着我国经济的发展以及人民生活水平的提高，糖尿病患病率逐年增加，严重危害人们的健康，给家庭和社会带来沉重的经济负担。最新大样本流行病学调查显示，中国成人糖尿病患病率为11.6％，其中男性患病率为12.1％，女性患病率为11％，城市居民为14.3％，农村居民为10.3％；调查结果还显示糖尿病前期率为50.1％。目前主要是使用口服降糖药及胰岛素替代治疗，不能根治，且存在很多不足。人羊膜来源干细胞包括人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，hAEC)、人羊膜间充质干细胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)。人羊膜干细胞可在体内及体外向外胚层来源的神经细胞、神经胶质细胞，内胚层来源的胰腺细胞、肝脏细胞以及中胚层来源的心肌样细胞、肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞方向分化，并且具有无性集落形成能力和抗炎性。作为很多细胞的前体，羊膜干细胞又能抑制细胞免疫。不同的抗血管生成和抗炎症的蛋白都在羊膜干细胞中表达，这也解释了羊膜的抗血管生成和抗炎症的作用。这些性质使得羊膜干细胞已在很多治疗起到辅佐作用，而且大多数效果显著。人羊膜干细胞在具有类似胚胎干细胞性质的同时，因其无致瘤性、低免疫排斥性、含量丰富、容易获取、不引起伦理争议，极有潜力成为临床应用的干细胞来源之一。近年来，随着干细胞技术的发展，羊膜干细胞移植已经成为新的疾病治疗的发展方向。在临床应用上，羊膜干细胞在结膜损伤修复、重建眼表、防治睑球粘连与视网膜移植等眼科临床已开展了大量工作，而且在糖尿病难愈性皮肤溃疡、烧伤等创面修复愈合方面也有积极的疗效。而且，已经有实验证据证明羊膜干细胞能够分化在一定条件下能够分化为胰岛细胞。同时，也有学者报道了人羊膜间充质干细胞治疗糖尿病的病例，并取得了良好的效果。虽然现在羊膜干细胞的应用研究上已经取得了一定的成果，并已经开始利用人羊膜间充质干细胞进行糖尿病治疗的研究。然而，现有的人羊膜间充质干细胞的提取和培养的方法仍比较复杂，且无法得到具有较高纯度和活性的人羊膜间充质干细胞。因此，开发一种便捷高效且能够产业化、规模化提取和培养人羊膜间充质干细胞的方法，就成了目前亟待解决的技术问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种人羊膜间充质干细胞分离培养方法，所述方法中，通过将人羊膜间充质干细胞从胎盘组织上分离、提取并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到人羊膜间充质干细胞。从而能够解决现有技术人羊膜间充质干细胞提取分离方法复杂等技术问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种人羊膜间充质干细胞提取分离方法，所述方法包括如下步骤：(1)将羊膜从胎盘组织上剥离，并清洗；(2)将清洗后的羊膜剪碎后，加入胰酶处理；(3)将胰酶处理后的组织清洗后，加入胶原酶I消化处理；(4)将消化处理后的组织过滤，并离心；(5)用培养液将离心后得到的细胞重悬后接种培养；(6)培养后细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得到人羊膜间充质干细胞。本专利技术中，通过将人羊膜间充质干细胞从胎盘组织上分离、提取并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到人羊膜间充质干细胞。可选的，本专利技术中，步骤(1)中所述清洗为以含3％双抗的HBSS缓冲溶液清洗。本专利技术中，通过使用含有双抗的HBSS缓冲溶液清洗剥离后所得的组织，从而能够在有效去除残留血迹的同时，还能够起到进一步消毒的作用。本专利技术中，步骤(1)中所述剥离是在无菌条件下进行的。本专利技术中，步骤(1)中所述剥离是采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离。本专利技术中，所述HBSS缓冲溶液为平衡盐溶液。本专利技术中，所述含3％双抗的HBSS缓冲溶液为含有3％青霉素和链霉素的HBSS缓冲溶液。本专利技术中，步骤(1)中所述清洗为多次清洗。可选的，本专利技术中，步骤(2)中所述胰酶处理为在33～38℃条件下处理25～35min；优选的，本专利技术中，步骤(2)中所述胰酶处理为在35～37℃条件下处理30～32min。可选的，本专利技术中，步骤(2)中所述胰酶为处理2～3次。本专利技术中，通过多次胰酶处理，从而能够充分的将羊膜上皮除去，从而得到高纯度的人羊膜间充质干细胞。可选的，本专利技术中，步骤(3)中所述消化处理为以浓度为0.3～0.6mg/ml的胶原酶I消化处理；优选的，本专利技术中，步骤(3)中所述消化处理为以浓度为0.4～0.5mg/ml的胶原酶I消化处理。可选的，本专利技术中，步骤(3)中所述消化处理为在35～39℃条件下消化处理1～2h；优选的，本专利技术中，步骤(3)中所述消化处理为在37～38℃条件下消化处理1～2h。本专利技术中，通过对消化处理温度和时间的调整，从而能够提高酶活性，并进一步提高酶解处理效率；同时还不会由于酶解时间过长所导致的处理效率过低以及对目标细胞组织的破坏。可选的，本专利技术中，步骤(3)中所述的消化处理是在水浴条件下进行的。可选的，本专利技术中，步骤(4)中所述离心为在转速为1300～1600rpm条件下，离心8～15min；优选的，本专利技术中，步骤(4)中所述离心为在转速为1400～1500rpm条件下，离心8～10min。本专利技术中，通过对离心转速以及离心时间等条件的选择和调整，从而能够在将人羊膜间充质干细胞充分离心得到的同时，还能够避免由于离心时间过长所导致的整体纯化处理效率的降低。可选的，本专利技术中，步骤(5)中所述培养是在35～38℃条件下CO2培养箱内进行的培养；优选的，本专利技术中，步骤(5)中所述培养是在36～37℃条件下CO2培养箱内进行的培养。可选的，本专利技术中，步骤(6)中所述胰酶消化是在35～38℃条件下消化3～6min；优选的，本专利技术中，步骤(6)中所述胰酶消化是在36～37℃条件下消化4～5min。本专利技术中，通过对消化处理温度和时间的调整，从而能够提高酶活性，并进一步提高酶解处理效率；同时还不会由于酶解时间过长所导致的处理效率过低以及对目标细胞组织的破坏。可选的，本专利技术中，步骤(5)所述接种培养是先将离心处理所得的细胞按1×106的细胞密度接种于10mm培养皿内，再放入37℃条件下的CO2培养箱内进行培养。可选的，本专利技术中，步骤(6)中所述培养基为DMEM/F12培养基。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术中，通过将人羊膜间充质干细胞从胎盘组织上分离、提取并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到人羊膜间充质干细胞；(2)本专利技术中，通过对酶解消化处理等步骤条件的选择、调整以及优化，从而进一步提高了本专利技术间充质干细胞提取纯化效率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为培养48h后，在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图2为培养基中细胞汇合度达到80％-90％时，4×显微镜下观察到的培养基中细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人羊膜间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将羊膜从胎盘组织上剥离，并清洗；(2)将清洗后的羊膜剪碎后，加入胰酶处理；(3)将胰酶处理后的组织清洗后，加入胶原酶I消化处理；(4)将消化处理后的组织过滤，并离心；(5)用培养液将离心后得到的细胞悬浮后接种培养；(6)培养后细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得到人羊膜间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人羊膜间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将羊膜从胎盘组织上剥离，并清洗；(2)将清洗后的羊膜剪碎后，加入胰酶处理；(3)将胰酶处理后的组织清洗后，加入胶原酶I消化处理；(4)将消化处理后的组织过滤，并离心；(5)用培养液将离心后得到的细胞悬浮后接种培养；(6)培养后细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得到人羊膜间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述清洗为以含3％双抗的HBSS缓冲溶液清洗。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述胰酶处理为在33～38℃条件下处理25～35min。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：张璐，李云华，于佳，孙飞，
申请(专利权)人：吉林省中科生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22