人羊膜组织神经干细胞分离纯化的方法技术

本发明专利技术涉及了人羊膜组织神经干细胞分离纯化的方法，它包括以下步骤：（ａ）清洗人羊膜组织；（ｂ）从上述人羊膜组织中分离出上皮细胞；（ｃ）从人羊膜组织中分离出人羊膜组织间充质细胞；（ｄ）从人羊膜组织间充质细胞中分离出神经干细胞，本发明专利技术的方法通过分离上皮细胞、收集间充质细胞并根据神经干细胞表达ＣＤ１３３抗体的特点，采用免疫磁珠细胞分离法，从人羊膜组织间充质细胞中分离出ＣＤ１３３阳性神经干细胞，再采用神经干细胞培养液继续培养神经干细胞，该方法大大降低了人羊膜组织来源神经干细胞分离纯化的成本，提高了神经干细胞的成活率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及了一种神经干细胞分离纯化的方法，特别是涉及了一种从人羊膜组织中分离和纯化神经干细胞的方法。
技术介绍
目前，利用神经干细胞培养液和细胞克隆技术，从胚胎或胎脑中分离纯化神经干细胞的方法已基本成熟，由于脑组织中只有干细胞具有增殖分裂活性，故此方法可有效应用于脑源性神经干细胞的分离纯化，而目前还没有文献资料报道过从人羊膜组织中分离纯化神经干细胞的方法。此外，人羊膜组织内除具有增殖分裂活性的神经干细胞外，还存在有上皮干细胞和间充质干细胞，而且神经干细胞数量远少于胎脑，利用上述已知的方法分离纯化人羊膜组织中的神经干细胞，将大大提高成本，降低神经干细胞的成活率。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种从人羊膜组织中分离纯化神经干细胞的方法。为了实现这一专利技术目的，本专利技术提供了一种，它包括以下步骤(a)清洗人羊膜组织；(b)从上述人羊膜组织中分离出上皮细胞；(c)从人羊膜组织中分离出人羊膜组织间充质细胞；(d)从人羊膜组织间充质细胞中分离出神经干细胞；本专利技术提供了一种，其中所述步骤(a)包括以下步骤(1)将人羊膜组织漂洗、浸泡和消毒；(2)将人羊膜组织剪成约为1-2mm3的碎片；(3)将人羊膜组织碎片送入离心管中，加入含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s缓冲液；(4)混合上述溶液，混合均匀后将上述溶液放置在生物振荡器内，在温度为37℃左右、生物振荡器的转速为80-120rpm的条件下，震摇10-20分钟；(5)去除得到的上清液，完成了人羊膜组织的清洗；本专利技术提供了一种，其中所述步骤(b)包括以下步骤(1)将清洗后的人羊膜组织加入到含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s缓冲液中；(2)混合上述溶液，混合均匀后将上述溶液放置在生物振荡器内，在温度为37℃左右、生物振荡器的转速为400-600rpm的条件下，震摇20-40分钟；(3)用细胞筛过滤混悬液，收集从人羊膜组织中分离出来的上皮细胞；(4)重复上述(1)至(3)步骤2-3次，收集每次从人羊膜组织中分离出来的所有上皮细胞并计数；(5)将上述上皮细胞接种在培养瓶中；本专利技术提供了一种，其中所述步骤(c)包括以下步骤(1)将分离出了上皮细胞的人羊膜组织碎片用D-hank’s缓冲液漂洗；(2)将上述组织碎片加入到含有0.1％的V型胶原酶溶液中混合；(3)混合均匀后，将上述溶液放置在生物振荡器内，在温度为37℃左右、生物振荡器的转速为400-600rpm的条件下，震摇20-40分钟；(4)用细胞筛过滤混悬液，离心收集人羊膜组织间充质细胞并计数；本专利技术提供了一种，其中所述步骤(d)包括以下步骤(1)将上述收集的人羊膜组织间充质细胞接种于神经干细胞培养液中，培养至1×106-1×107细胞个数；(2)采用免疫磁珠细胞分离的方法，从人羊膜组织间充质细胞中分离出神经干细胞；本专利技术提供了一种，其中所述神经干细胞培养液包括含有20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、含有20ng/ml的表皮细胞生长因子(EGF)和B27的DMEM/F12无血清培养液；本专利技术提供了一种，其中根据神经干细胞表达CD133抗体的特点，将CD133抗体包被在免疫磁珠上，利用免疫磁珠细胞分离的方法，从人羊膜组织间充质细胞中分离出CD133阳性神经干细胞。本专利技术与从胚胎或胎脑中分离纯化神经干细胞的方法相比，本专利技术通过从人羊膜组织中分离上皮细胞、收集间充质细胞并根据神经干细胞表达CD133抗体的特点，采用免疫磁珠细胞分离法，从人羊膜组织间充质细胞中分离出CD133阳性神经干细胞，再采用神经干细胞培养液继续培养神经干细胞，该方法大大降低了从人羊膜组织中分离纯化神经干细胞的成本，提高了神经干细胞的成活率。具体实施例方式本专利技术公开了一种，它包括四大步骤，每一大步骤还包括若干个小步骤，其中以下为四大步骤(a)清洗人羊膜组织；(b)从上述人羊膜组织中分离出上皮细胞；(c)从人羊膜组织中分离出人羊膜组织间充质细胞；(d)从人羊膜组织间充质细胞中分离出神经干细胞。其中步骤(a)包括以下步骤(1)将人羊膜组织漂洗、浸泡和消毒；(2)将人羊膜组织剪成约为1-2mm3的碎片；(3)将人羊膜组织碎片送入50ml离心管中，加入含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s缓冲液；(4)混合上述溶液，混合均匀后将上述溶液放置在生物振荡器内，在温度为37℃左右、生物振荡器的转速为100rpm的条件下，震摇15分钟；(5)去除得到的上清液，完成了人羊膜组织的清洗。其中步骤(b)包括以下步骤(1)将清洗后的人羊膜组织加入到含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s缓冲液中；(2)混合上述溶液，混合均匀后将上述溶液放置在生物振荡器内，在温度为37℃左右、生物振荡器的转速为500rpm的条件下，震摇30分钟；(3)用细胞筛过滤混悬液，收集从人羊膜组织中分离出来的上皮细胞；(4)重复上述(1)至(3)步骤3次，收集每次从人羊膜组织中分离出来的所有上皮细胞并计数；(5)将上述上皮细胞接种在培养瓶中，以作为别的用途。其中所述步骤(c)包括以下步骤(1)将分离出了上皮细胞的人羊膜组织碎片用D-hank’s缓冲液漂洗；(2)将上述组织碎片加入到含有0.1％的V型胶原酶溶液中混合； (3)混合均匀后，将上述溶液放置在生物振荡器内，在温度为37℃左右、生物振荡器的转速为500rpm的条件下，震摇30分钟；(4)用细胞筛过滤混悬液，离心收集人羊膜组织间充质细胞并计数，以备后续使用。其中步骤(d)包括以下步骤(1)将上述收集的人羊膜组织间充质细胞接种于神经干细胞培养液中，培养至1×106-1×107细胞个数，神经干细胞培养液包括含有20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、含有20ng/ml的表皮细胞生长因子(EGF)和B27(商品名称)的DMEM/F12无血清培养液；B27(商品名称)的用量可以根据产品说明书的介绍进行添加。(2)根据神经干细胞表达CD133抗体的特点，将CD133抗体包被在免疫磁珠上，利用免疫磁珠细胞分离的方法，从人羊膜组织间充质细胞中分离出CD133阳性神经干细胞。分离出来的神经干细胞经培养液继续培养。以上描述是对本专利技术的解释，不是对专利技术的限定，本专利技术所限定的范围参见权利要求，在不违背本专利技术的精神的情况下，本专利技术可以作任何形式的修改。权利要求1.一种，其特征在于它包括以下步骤(a)清洗人羊膜组织；(b)从上述人羊膜组织中分离出上皮细胞；(c)从人羊膜组织中分离出人羊膜组织间充质细胞；(d)从人羊膜组织间充质细胞中分离出神经干细胞。2.如权利要求1所述的，其特征在于所述步骤(a)包括以下步骤(1)将人羊膜组织漂洗、浸泡和消毒；(2)将人羊膜组织剪成约为1-2mm3的碎片；(3)人羊膜组织碎片送入离心管中，加入含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s缓冲液；(4)混合上述溶液，混合均匀后将上述溶液放置在生物振荡器内，在温度为37℃左右、生物振荡器的转速为80-120rpm的条件下，震摇10-20分钟；(5) 去除得到的上清液，完成了人羊膜组织的清洗。3.权利要求2所述的，其特征在于所述步骤(b)包括以下步骤(1)将清洗后的人羊膜组织加入到含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s缓冲液中；(2)混合上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人羊膜组织神经干细胞分离纯化的方法，其特征在于：它包括以下步骤：（ａ）清洗人羊膜组织；（ｂ）从上述人羊膜组织中分离出上皮细胞；（ｃ）从人羊膜组织中分离出人羊膜组织间充质细胞；（ｄ）从人羊膜组织间充质细胞中 分离出神经干细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡哲，张岚，潘琳，舒峻，
申请(专利权)人：中日友好医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]