本发明专利技术为一种人羊膜间充质干细胞的分离及培养方法及医用组合物，分离及培养方法是将人羊膜用胰蛋白酶、胶原酶、脱氧核糖核酸酶相继消化，然后过滤制成单细胞悬液，再采用加有体积百分含量为１０％－２０％的胎牛血清和终浓度为１０－２０ｎｇ／ｍｌ的碱性成纤维生长因子的Ｖ↓［ＤＭＥＭ］∶Ｖ↓［Ｆ１２］＝１∶１的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，置于３７℃、饱和湿度、体积分数为５％的ＣＯ↓［２］培养箱中进行培养，通过换液和传代，使人羊膜间充质干细胞逐渐得到扩增和纯化。本发明专利技术方法具有来源广泛，不受伦理限制等优越性，具有广阔的应用前景，本发明专利技术的医用组合物可用于神经替代治疗、用于心肌梗塞的治疗、用于糖尿病的治疗、用于骨组织工程、应用于整形外科等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于间充质干细胞的分离及培养方法，具体涉及的是一种人羊膜间充质干细胞的分离及体外培养方法，以及含有人羊膜间充质干细胞作为有效成分的医用组合物。
技术介绍
近几年来，干细胞的研究取得了重大突破.1999和2000年，世界最权威的美国《Science》杂志连续2年将干细胞和人类基因组计划列为当年的10大科学突破，尤其是在1999年甚至将干细胞研究列为第一位。干细胞很可能在医学领域引发革命性进步，因而具有不可估量的医学价值而引起全世界的广泛关注和研究，美国《时代》周刊认为干细胞和人类基因组计划将同时成为新世纪最具有发展和应用前景的领域。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，简称MSCs)是来源于成熟组织中的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞移植和组织工程的新型种子细胞，具有广阔的应用前景。其中，研究最为广泛的MSCs是来源于骨髓的间充质干细胞，尽管其伦理问题与胚胎干细胞相比大为减少，但骨髓细胞必须通过侵入的途径获得，及其随着年龄的增长，干细胞数量显著减少。许多研究机构已经在其它组织中寻找到多能干细胞，包括动员的外周血、脐血、乳牙、脐带间充质细胞，然而，从这些组织中得到的细胞数量十分有限。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于针对现有干细胞来源或者受伦理限制或者数量有限的问题，提供一种不受伦理限制且来源广泛的人羊膜间充质干细胞的分离及培养方法。本专利技术的第二个目的在于利用本专利技术的方法制得的人羊膜间充质干细胞，提供一种医用组合物。本专利技术的第一个目的是这样实现的本专利技术包括如下顺序的步骤(1)取人羊膜先用胰蛋白酶消化，然后用胶原酶、脱氧核糖核酸酶消化，得到细胞悬液；(2)将上一步所得的细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；(3)将第(2)步所得细胞接种于培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，并通过换液和传代，使人羊膜间充质干细胞逐渐得到扩增和纯化，所述培养基采用VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养基，其中含有体积百分含量为10％-20％的胎牛血清和终浓度为10-20ng/ml的碱性成纤维生长因子。在上述第(1)步中，优选采用重量百分含量为0.125-0.25％的胰蛋白酶，室温消化30-60分钟，共2-4次，然后用含体积百分含量为10％-20％胎牛血清的DMEM/F12培养液中止胰蛋白酶，采用含0.5-2.0g/L胶原酶和0.05-0.20g/L脱氧核糖核酸酶的VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养液，37℃消化1-2小时。在上述第(3)步中，优选将第(2)步所得细胞以1×105-1×106/ml密度接种于培养基中培养。将细胞扩增和纯化的过程优选如下在本专利技术的第(3)步开始细胞培养后，培养48～72小时，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3～4天全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例或1∶3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程。本专利技术的医用组合物，包括通过本专利技术所述的方法制得的人羊膜间充质干细胞，优选包括人羊膜间充质干细胞和纤维蛋白胶的医用组合物。本专利技术的医用组合物可用于神经替代治疗、用于心肌梗塞的治疗、用于糖尿病的治疗、用于骨组织工程、应用于整形外科。本专利技术的优点在于人羊膜是胎儿出生以后的废弃物，本专利技术从羊膜分离、体外培养人羊膜间充质干细胞(Human Amniotic-derivedmesenchymal stem cells，简称HADMSCs)，具有来源广泛，不受伦理限制等优越性；本专利技术的医用组合物含有能够分化为中胚层及其它胚层的成熟组织的人羊膜间充质干细胞，应用广泛。附图说明图1是实施例一中培养不同时间的HADMSCs的放大100倍的显微照片。图2是实施例一中流式细胞分析结果图。图3是实施例二中HADMSCs经诱导向神经细胞分化的细胞照片，其中A为诱导4天的放大100倍的照片；B为诱导7天的照片；C为诱导前细胞表达nestin的照片，放大200倍；D为诱导7天细胞表达NSE的照片，放大200倍。图4是实施例三中移植后神经细胞表达特异性标志物的照片，其中A、B、C、D为HADMSCs移植组，放大400倍，A、B为移植后2周、4周移植细胞表达GFAP的照片，C、D为移植后2周、4周移植细胞表达NSE的照片；E、F、G、H为纤维蛋白胶和HADMSCs混合移植组，放大400倍，E、F为移植后2周、4周移植细胞表达GFAP的照片，G、H为移植后2周、4周移植细胞表达NSE的照片。具体实施例方式实施例一人羊膜间充质干细胞的分离、培养、扩增及纯化1、人羊膜间充质细胞的分离在无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的人胎盘，钝性分离胎盘脐带面的羊膜，用磷酸缓冲液(PBS)充分冲洗，将羊膜剪成1.0cm×1.0cm大小的片状，按每克组织加入重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶2ml，室温消化30分钟，共3次，然后用含体积百分含量为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液中止胰蛋白酶，以尽可能除去上皮细胞。然后将羊膜尽可能剪碎，以每克组织加入含1.0g/L胶原酶和0.10g/L脱氧核糖核酸酶的VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养液2ml，37℃消化1小时后得细胞悬液。然后用不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000r/m离心10分钟，用PBS洗2次，用台盘兰染色，计数活细胞，以2×105/ml的密度将所得细胞接种于75ml培养瓶内。本专利技术在接种时的细胞密度可采用1×105-1×106/ml。2、人羊膜间充质干细胞的培养、纯化及扩增培养基采用VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养基，其中加了体积百分含量为10％的胎牛血清(FBS)和终浓度为20ng/ml的碱性成纤维生长因子(bFGF)，将上一过程所得的人羊膜间充质细胞分装于75ml培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中培养48-72小时后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3-4天全量换液一次。待细胞达到80％-90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2或1∶3的比例的比例进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作进行传代，此传代培养记为P2代，然后继续上述传代培养过程。细胞于24小时内开始贴壁，72小时观察，见细胞呈圆形、梭形、星形、多角形等多种形态，通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，此时贴壁细胞呈单个分散或几个细胞的克隆，10天以后细胞形态逐渐均匀，呈长梭形，有伪足，14天左右可见两种细胞克隆上皮样细胞克隆和成纤维样细胞克隆，前者是杂细胞，后者是人羊膜间充质干细胞HADMSCs，每个克隆约含200～300个细胞，培养至14～18天细胞达80％～90％融合，见成纤维样细胞呈放射状或漩涡状分布，上皮样细胞呈铺路石样排列。传代后细胞24小时内完全贴壁，7～10天达到完全融合，传至3代，细胞形态很均匀，上皮样本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人羊膜间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于包括如下顺序的步骤：（１）取人羊膜先用胰蛋白酶消化，然后用胶原酶、脱氧核糖核酸酶消化，得到细胞悬液；（２）将上一步所得的细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；（３）将第（２） 步所得细胞接种于培养基中，置于３７℃、饱和湿度、体积分数为５％的ＣＯ↓［２］培养箱中进行培养，并通过换液和传代，使人羊膜间充质干细胞逐渐得到扩增和纯化，所述培养基采用Ｖ↓［ＤＭＥＭ］∶Ｖ↓［Ｆ１２］＝１∶１的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，其中含有体积百分含量为１０％－２０％的胎牛血清和终浓度为１０－２０ｎｇ／ｍｌ的碱性成纤维生长因子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡祥，杨波，
申请(专利权)人：深圳市北科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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