一种食管上皮干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术公开一种食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤为：首先，取食管黏膜组织及附着的上皮，去除肌肉组织，取黏膜上皮组织的基底层并剪成碎片，消化离心，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；然后，加入添加有HEPES、碳酸氢钠、L-谷氨酸、FBS、EGF、胰岛素、氢化可的松、霍乱弧菌毒素、转铁蛋白、BPE、类维生素A、细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham’s F-12培养液；最后，将含有细胞悬液的培养瓶、培养板或培养皿放入37℃孵箱中培养，10～14天即可形成单层上皮干细胞。本发明专利技术操作简便，安全性好，分离得到食管上皮干细胞，干细胞的活性高，在组织工程和再生医学领域应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学
，涉及干细胞分离培养技术，尤其是涉及一种食管上皮干细胞的分离培养方法。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(EmbryonicStemCells,ESCs)和成体干细胞(AdultStemCells,ASCs)。胚胎干细胞的增殖与分化是构成个体发育的基础，由单个的受精卵发育成具备各种组织器官的个体；而成体干细胞可进一步分化为复杂的组织器官，其研究几乎涉及所有的生命科学和生物医药领域，具有光明的发展前景。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞(StemCell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞是机体生长和发育的起源细胞，具有持久自我更新、高度增殖分裂、多向分化潜能和对疾病损伤具有反应能力的细胞群体。由于其独特的生物学特性和功能，使之成为生命科学和生物医药领域最引人注目的研究热点之一。食管的黏膜上皮是由一群复杂而有高度组织化的未角化复层扁平上皮排列而成。食管上皮可分为两个带：一是基底带，包括几层小的嗜碱性细胞，另一是分化带，包括多层规则排列的分化的鳞状上皮。基底带中贴紧基底膜的一层细胞称为基底层，覆盖其上的数层称上皮基底层。在解剖学上基底层可以进一步的分为两种成分：一种是扁平的称乳头间基底层（theinterpapillarybasallayer，IBL），另一种是覆盖在乳头表面的，称乳头基底层（thepapillarybasallayer，PBL）。只有基底带的细胞才有分化能力，并且这种分化是以细胞从基底层移向食管腔面完成的，细胞的迁移、分化起始与分化标志物的表达结果有关。相对于IBL，PBL中的细胞分裂是比较均匀的，可产生2个子细胞紧贴基底膜，相反地，在IBL中细胞分裂本质上是不均匀的，其细胞分裂主要发生于基底膜的右角，产生一个停留于基底层的子细胞及一个进入基底上层的子细胞。因此，IBL中的细胞就相当于食管上皮干细胞。研究表明，人食管上皮细胞的原代培养方法研究较多，但目前未有研究食管上皮干细胞分离培养方法的报道。食管上皮干细胞具有旺盛的增殖分化能力，在维持食管粘膜屏障结构、功能的完整性、以及食管粘膜的损伤修复中起着至关重要的作用。而食管干细胞培养方法的建立，对于研究食管粘膜的增生与分化细胞以及食管肿瘤的发生发展具有重要的意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种食管上皮干细胞的分离培养方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种食管上皮干细胞的分离培养方法，其包括以下步骤：步骤1、取食管黏膜组织及附着的上皮，去除肌肉组织，取黏膜上皮组织的基底层并将其剪成碎片，消化离心，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；步骤2、加入添加有10～20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（HEPES）、2～5mmol/L碳酸氢钠、2～5mmol/LL-谷氨酸、体积分数2～5％的胎牛血清（FBS）、20～30ng/mL人表皮生长因子（EGF）、3～6mg/mL胰岛素、50～150mmol/L氢化可的松、0.05～0.2mg/mL霍乱弧菌毒素、4～6mg/mL转铁蛋白、20～40mg/mL牛垂体提取物(BPE)、0.01～0.02mmol/L类维生素A、8～25mmol/L细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham’sF-12培养液；步骤3、将含有细胞悬液的培养瓶、培养板或培养皿放入37℃孵箱中培养，2～3天可见到细胞贴壁，之后隔天更换一次培养液以去除杂质细胞的影响，10～14天即可形成单层上皮干细胞。上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤1中，消化的方法是：将碎片加入含有0.1～0.3%胶原酶I型、0.1～0.3%链酶蛋白酶和0.5～1.0mg/ml脱氧核糖核酸酶I的Ham’sF12-DMEM1/1溶液中，37℃恒温消化2～4h，离心后过滤，即得细胞。进一步地，上述的Ham’sF12-DMEM1/1溶液中，还含有10～20mg/ml牛血清蛋白（BSA），以保护细胞免受机械和酶作用的损伤，还有去毒化的作用。上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤1中，包被在培养瓶上的基质为胶原酶、牛血清白蛋白中的一种或两种组合。上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤1中，培养瓶、培养板或培养皿包被的方法为：加入含0.1～0.5mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和/或30～50ug/mL胶原酶Ⅰ的EBSS培养液，完全覆盖培养瓶、培养板或培养皿底部即可，在37℃恒温孵箱中孵育1～2小时，孵育完后吸弃培养液，用无菌PBS清洗3～5次。由于包被的基质中含有胶原酶和蛋白等成分，能促进干细胞较快地贴壁和生长。上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤2的培养液中，细胞信号通路抑制剂含有：浓度为5～10mM的ROCKi、浓度为1～5mM的TGF-β抑制剂A83-01、浓度为1～5mM的BMP抑制剂DMH1、浓度为1～5mM的GSK抑制剂CHIR99021。上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤2的培养液中还含有抗生素，抗生素为0.25～0.5mg/mL两性霉素B和200～400mg/mL青霉素/链霉素液。上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤2中的培养液中添加有12～16mmol/L4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（HEPES）、3～4.5mmol/L碳酸氢钠、3～4.5mmol/LL-谷氨酸、体积分数2～4％的胎牛血清（FBS）、23～27ng/mL人表皮生长因子（EGF）、4～5.5mg/mL胰岛素、70～130mmol/L氢化可的松、0.1～0.18mg/mL霍乱弧菌毒素、4.5～5.5mg/mL转铁蛋白、25～35mg/mL牛垂体提取物(BPE)、0.01～0.02mmol/L类维生素A、10～20mmol/L细胞信号通路抑制剂。一种食管上皮干细胞的分离培养液，其为添加有10～20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（HEPES）、2～5mmol/L碳酸氢钠、2～5mmol/LL-谷氨酸、体积分数2～5％的胎牛血清（FBS）、20～30ng/mL人表皮生长因子、3～6mg/mL胰岛素、50～150mmol/L氢化可的松、0.05～0.2mg/mL霍乱弧菌毒素、4～6mg/mL转铁蛋白、20～40mg/mL牛垂体提取物(B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食管上皮干细胞的分离培养方法，其特征是：其包括以下步骤：步骤1、取食管黏膜组织及附着的上皮，去除肌肉组织，取黏膜上皮组织的基底层并将其剪成碎片，消化离心，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；步骤2、加入添加有10～20mmol/L 4‑羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、2～5mmol/L碳酸氢钠、2～5mmol/L L‑谷氨酸、体积分数2～5％的胎牛血清、20～30ng/mL人表皮生长因子、3～6mg/mL胰岛素、50～150mmol/L氢化可的松、0.05～0.2mg/mL霍乱弧菌毒素、4～6mg/mL转铁蛋白、20～40mg/mL牛垂体提取物、0.01～0.02mmol/L类维生素A、8～25mmol/L细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham’s F‑12培养液；步骤3、将含有细胞悬液的培养瓶、培养板或培养皿放入37℃孵箱中培养，2～3天可见到细胞贴壁，10～14天即可形成单层上皮干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种食管上皮干细胞的分离培养方法，其特征是：其包括以下步骤：
步骤1、取食管黏膜组织及附着的上皮，去除肌肉组织，取黏膜上皮组织的基底层并将
其剪成碎片，消化离心，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；
步骤2、加入添加有10～20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、2～5mmol/L碳酸氢
钠、2～5mmol/LL-谷氨酸、体积分数2～5％的胎牛血清、20～30ng/mL人表皮生长因子、3～
6mg/mL胰岛素、50～150mmol/L氢化可的松、0.05～0.2mg/mL霍乱弧菌毒素、4～6mg/mL转铁
蛋白、20～40mg/mL牛垂体提取物、0.01～0.02mmol/L类维生素A、8～25mmol/L细胞信号通
路抑制剂的DMEM/Ham’sF-12培养液；
步骤3、将含有细胞悬液的培养瓶、培养板或培养皿放入37℃孵箱中培养，2～3天可见
到细胞贴壁，10～14天即可形成单层上皮干细胞。
2.根据权利要求1所述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其特征是：其步骤1中，消化
的方法是：将碎片加入含有0.1～0.3%胶原酶I型、0.1～0.3%链酶蛋白酶和0.5～1.0mg/ml
脱氧核糖核酸酶I的Ham’sF12-DMEM1/1溶液中，37℃恒温消化2～4h，离心后过滤，即得细
胞。
3.根据权利要求2所述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其特征是：其Ham’sF12-
DMEM1/1溶液中还含有10～20mg/ml牛血清蛋白。
4.根据权利要求3所述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其特征是：其步骤1中，包被
在培养瓶上的基质为胶原酶、牛血清白蛋白中的一种或两种组合。
5.根据权利要求1所述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其特征是：其步骤1中，培养
瓶、培养板或培养皿包被的方法为：加入含0.1～0.5mg/mL牛血清白蛋白和/或30～50ug/mL
胶原酶Ⅰ的EBSS培养液，完全覆盖培养瓶、培养板或培养皿底部即可，在37℃恒温孵箱中孵
育1～2小时，孵育完后吸弃培养液，用无菌PBS清洗3～...

【专利技术属性】
技术研发人员：高社干，冯笑山，梁硕，牟红梅，刘刚，原翔，马志坤，孔金玉，
申请(专利权)人：河南科技大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南;41