一种干细胞培养体系制造技术

本发明专利技术公开了一种干细胞培养体系，包括无血清培养基、支架材料，所述支架材料包括由壳聚糖和明胶制作而成的骨架、包被于所述骨架上的卵磷脂和多聚赖氨酸。本发明专利技术具有以下优点和效果：采用具有良好生物相容性的壳聚糖和明胶制作成骨架，卵磷脂和多聚赖氨酸包被在骨架外，提高干细胞容易吸附在支架材料上，其次，加入纤维连接蛋白，加固连接，达到了支架材料细胞吸附性好、提高干细胞与支架材料安全性的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生命科学
，特别涉及一种干细胞培养体系。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下它可以分化为多种功能细胞.干细胞可以作为组织工程中的种子细胞,与支架材料按一定比例混合,使干细胞黏附于支架材料上形成细胞-支架材料复合物,并在体外诱导干细胞分化,然后将该复合物植入集体的组织或器官病损部位.随着支架材料在机体内逐渐降解和吸收,植入的已分化干细胞在机体内不断增殖并分泌细胞外基质,最终形成相应的组织或器官,从而达到修复创伤和重建功能的目的。生物材料支架所形成的三维结构为细胞获取营养、生长和代谢提供了一个良好的环境。在干细胞体外增殖和分化的过程中,一般采用在培养基内加入胎牛血清,胎牛血清是一种细胞培养中常用的天然培养基,含有丰富的营养成分,常用于动物细胞的体外培养,是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子的来源。但是胎牛血清存在以下缺点：一是胎牛血清中含有未知的成分，可能会干扰干细胞的增殖和分化，二是胎牛血清中含有微量的血红蛋白和内毒素，会干扰干细胞的生长和增殖。为解决上述问题，申请公布号为CN105112365A的中国专利《一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法》公开了一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分：重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白、维生素C、生物素、干细胞生长因子和干细胞因子。但是该人脐带间充质干细胞的无血清培养基存在以下缺点:采用上述培养基培养干细胞和支架材料时，由于没有胎牛血清，培养基内缺少细胞贴壁黏附在支架材料上的所需因子，导致培养过程中干细胞不易黏附于支架材料上。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种干细胞培养体系，具有干细胞容易黏附于支架材料上的效果。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种干细胞培养体系，包括无血清培养基、支架材料，所述支架材料包括由壳聚糖和明胶制作而成的骨架、包被于所述骨架上的卵磷脂和多聚赖氨酸。通过采用上述技术方案，通过在无血清培养基内培养干细胞，培养基成分确定，没有血红蛋白和肉毒素，培养出来的组织安全可靠。支架材料包括骨架、卵磷脂和多聚赖氨酸。支架材料的选择是组织工程中重要的部分，支架材料除了具有良好的生物相容性和生物可降解性，还需要有亲水性和良好的细胞吸附性。在骨架外包被有卵磷脂，卵磷脂兼具非极性的碳链和高度极性的磷酸负离子，能在溶液内分散而形成胶束，非极性的碳链聚集在胶束中间并且极性的一端暴露在水中，使得支架材料具有良好的亲水性，避免出现溶液在支架材料表面不易扩散的现象。鉴于无血清培养基内没有血清成分，导致干细胞增殖过程中缺少贴壁生长所需要的因子，在支架材料表面还包被有多聚赖氨酸，多聚赖氨酸具有良好的细胞吸附性，能明显促进干细胞的黏附，并且能促进干细胞分泌基质，使附着于支架材料上的干细胞不易脱落。支架材料中的骨架由壳聚糖和明胶制作而成，壳聚糖为天然多分子，是甲壳素脱乙酰化的产物，具有良好的生物组织相容性，植入生物机体后能被降解。但是壳聚糖制作而成的支架具有脆性大、韧性差、降解慢的缺点。通过在壳聚糖内加入明胶制作成骨架，明胶是天然生物高分子材料，加入明胶后提高骨架的韧性，降低骨架的脆性，使得支架材料满足组织工程的需求。在干细胞培养过程中，由于干细胞不断地增殖和生长，卵磷脂和多聚赖氨酸一旦从骨架上脱落，骨架就会裸露出来，所以骨架本身也必须具有良好的细胞吸附性。骨架材料中的明胶是一种非晶体物质，具有良好的细胞吸附性，进一步保证支架材料的细胞吸附性。达到了干细胞容易吸附到支架材料上的效果本专利技术的进一步设置为：所述骨架由以下方法制得：a)将壳聚糖粉末溶于乙酸溶液中，搅拌均匀后离心、脱气、脱扎，得到壳聚糖溶液；b)将得到的壳聚糖溶液加入到模具内，预冻处理后，再进行冻干，得到冻干架；c)将明胶溶液滴加到冻干架上，通风干燥；d)将冻干架用磷酸二氢钠冲洗，中和未反应的乙酸后；e)将冻干架放入到碳酰二亚胺胶交联剂中处理后，在乙醇溶液内浸泡后，再用三蒸水浸泡洗涤，去除未交联的碳酰二亚胺；f)冻干处理后，得到所述骨架。通过采用上述技术方案，将壳聚糖溶于乙酸后形成壳聚糖溶液，在模具中制作成组织工程所需要的形状。冻干架在预冻后被冻干，形成海绵状多孔结构，干细胞黏附在支架材料上时分泌的物质能在多孔结构内流通，使得干细胞获得有效的物质传递，为黏附于支架材料上的干细胞提供一个能有效进行物质与能量传递的环境。虽然明胶的加入能增强支架材料的韧性，但是由于壳聚糖分子主要呈线性，使得支架材料的机械强度较弱，通过碳酰二亚胺交联处理，使得壳聚糖分子形成三维网状结构，提高支架材料的机械结构强度，同时还能减缓支架材料的降解速度。本专利技术的进一步设置为：以质量百分比计,所述壳聚糖溶液的浓度为0.8％。通过采用上述技术方案，选用浓度较低的壳聚糖溶液浓度，使得被冻干处理后的骨架内部结构比较粗糙，利于干细胞的吸附。本专利技术的进一步设置为：所述骨架内设有空腔、位于所述空腔内胶状物，所述胶状物由Ⅰ型胶原和用于诱导干细胞分化的诱导因子溶液混合而成。通过采用上述技术方案，诱导因子是指促进干细胞增殖分化的外源诱导因子，通过将诱导因子与Ⅰ型胶原混合成胶状物后注入到空腔内，能起到缓慢释放诱导因子的作用。当干细胞刚开始黏附于支架材料上时，诱导因子还未释放，干细胞不断地扩增，当诱导因子逐渐释放，通过支架上的多空结构接触到干细胞后，促进干细胞分化成组织特异性细胞。干细胞在未分化时植入生物机体内具有致瘤性，存在安全隐患，通过在支架材料由内而外释放诱导因子，使得吸附在支架材料上的干细胞均能接触到诱导因子，促进干细胞的分化，保证干细胞与支架材料植入生物机体后的安全性。本专利技术的进一步设置为：所述干细胞培养体系中还包括纤维连接蛋白。通过采用上述技术方案，纤维连接蛋白是一族高分子蛋白质，能促进细胞与基质间连接的生理作用，干细胞在黏附生长时会分泌一层附着于支架材料上的细胞基质，在培养基内加入纤维连接蛋白后，使得干细胞能牢固地吸附在支架材料上。本专利技术的进一步设置为：所述纤维连接蛋白浓度为10μg/L-50μg/L。通过采用上述技术方案，使得纤维连接蛋白保持在合适的浓度，不会影响干细胞的正常增殖。本专利技术的进一步设置为：所述纤维连接蛋白浓度为30μg/L。通过采用上述技术方案，纤维连接蛋白的浓度为30μg/L，既不会影响干细胞的增殖，有能使得干细胞吸附牢固。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：采用具有良好生物相容性的壳聚糖和明胶制作成骨架，卵磷脂和多聚赖氨酸包被在骨架外，提高干细胞容易吸附在支架材料上，其次，加入纤维连接蛋白，加固连接，达到了支架材料细胞吸附性好、提高干细胞与支架材料安全性的效果。具体实施方式具体实施例仅仅是对本专利技术的解释，其并不是对本专利技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本专利技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。实施例1：一种干细胞培养体系,可用于哺乳动物干细胞培养。包括无血清培养基和支架材料。无血清培养基可以采用商品化的无血清培养基，也可以按以下比例配制，包括α-MEM培养基添加10mg/LbFGF、10mg/LEGF、5g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞培养体系，包括无血清培养基、支架材料，其特征在于：所述支架材料包括由壳聚糖和明胶制作而成的骨架、包被于所述骨架上的卵磷脂和多聚赖氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞培养体系，包括无血清培养基、支架材料，其特征在于：所述支架材料包括由壳聚糖和明胶制作而成的骨架、包被于所述骨架上的卵磷脂和多聚赖氨酸。2.根据权利要求1所述的一种干细胞培养体系，其特征在于：所述骨架由以下方法制得：a)将壳聚糖粉末溶于乙酸溶液中，搅拌均匀后离心、脱气、脱扎，得到壳聚糖溶液；b)将得到的壳聚糖溶液加入到模具内，预冻处理后，再进行冻干，得到冻干架；c)将明胶溶液滴加到冻干架上，通风干燥；d)将冻干架用磷酸二氢钠冲洗，中和未反应的乙酸后；e)将冻干架放入到碳酰二亚胺胶交联剂中处理后，在乙醇溶液内浸泡后，再用三蒸水浸泡洗涤，去除未交联的碳酰二亚胺；f)冻干...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪铮，吴振化，
申请(专利权)人：浙江译美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33