深层过滤单克隆抗体细胞培养液的方法技术

本发明专利技术提供了一种中试放大规模澄清过滤抗PD‑1单克隆抗体的方法，该方法是采用D0HC和A1HC过滤膜两级深层过滤，通过小试模拟深层过滤的过程，采用测试得到的数据拟合数学方程计算得到中试规模所需深层过滤膜的面积，同时优化其它工艺参数而得到的，该方法能够使中试放大规模澄清过滤抗PD‑1单克隆抗体时，使用尽量少面积的深层过滤膜，节约生产成本，而滤膜压力终点不大于15psi，过滤澄清液浊度小于20NTU，适合工业化放大生产。

Method for deep filtering monoclonal antibody cell culture medium

The invention provides a pilot scale filtration and clarification of anti PD 1 monoclonal antibody method, this method is the use of D0HC and A1HC filter two level deep filtration through laboratory simulation process of deep bed filtration, using data fitting mathematical equation obtained in the pilot scale test required deep filtration area. At the same time, the optimization of other parameters obtained, this method can make the pilot scale filtration and clarification of anti PD 1 monoclonal antibody, the use of deep filtration area as little as possible, save the production cost, and membrane pressure end point is not greater than 15psi, the filtration and clarification of turbidity is less than 20NTU, suitable for industrial scale production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗体药物纯化方法领域，具体内容涉及中试规模澄清过滤抗PD-1单克隆抗体细胞液的方法。
技术介绍
通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物已经成为生物制药领域的一个重要方面由于单克隆抗体药物专一性强、疗效显著，因此成为近年来研究的热点药物之一。其中，针对PD-1受体的单克隆抗体药物更为众多国内外医药研发机构所关注。程序性死亡受体1(ProgrammedDeath-1)，也称之PD-1和CD279，最初是在1992年从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆得到并命名。PD-1是免疫球蛋白超家族CD28家族成员，相对分子量为50～55KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白。PD-1是T细胞免疫抑制受体，在激活的T细胞和B细胞中高表达，在肿瘤细胞中可限制T细胞效应子的功能，同时在调控肿瘤免疫逃逸以及自身免疫反应方面起着关键性的作用。PD-1作为受体，它的配体有两个PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。PD-1与PD-L1结合可以激活TCR和BCR，促使PD-1的ITSM结构域中的Tyr磷酸化，进而使SH2结构域(包括SHP-2和SHP-1)结合到PD-1的胞桨区，引起CD28调控的PI3K去磷酸化，抑制下游AKT/ERK等通路的活化，导致T细胞活化所需的基因及细胞因子转录和翻译被抑制。PD-1同时也可以抑制其他信号分子的磷酸化，比如CD3，ZAP70和PCK。PD-1/PD-L1信号通路的免疫抑制作用对多种免疫失调性疾病的发生及发展具有重要作用。单克隆抗体生产的细胞培养阶段目前多采用悬浮细胞高密度培养，细胞培养完成后所获得的含有抗体的细胞培养液会含有蛋白酶、宿主细胞、细胞碎片等污染物，影响抗体的稳定性和纯度，需要经过去除使细胞液澄清后才能用于后续的抗体分离纯化过程。细胞培养液澄清的方法有很多，比如离心，中空纤维过滤，表面过滤，深层过滤等，而深层过滤是目前国内外单抗生产细胞培养液澄清的主要方法。深层过滤指的是利用多孔介质从流动相中截留固体颗粒而不是表面截留，且一般介质表面都带有正电荷，可以通过静电吸附的方式来拦截杂质颗粒。深层过滤一般应用介质层较厚的滤床类(如沙层、硅藻土等)作为过滤介质，小于介质空隙的颗粒可进入到介质内部，而长而曲折的孔道中被截留并附着于介质之上。目前行业内拥有深层过滤介质产品的公司包括赛多利斯，默克密理博，PALL，3M等公司。例如赛多利斯公司的SartoclearDynamics和PALL公司的SeitzBS、SeitzHR系列都常用于哺乳动物细胞的澄清过滤。深层过滤过程有别于表面过滤，是一种逐渐堵塞的过程，在一定的膜通量条件下，随着时间的进行，澄清过滤的料液体积逐渐增大，深层滤膜的压降也逐渐增大，滤过的澄清液的浊度也变大，整个过滤过程相当复杂，例如过程所需的膜面积与过滤时间、过滤体积和压降相关。在实际工艺放大过程中，对于不同特性的抗体细胞的过滤，若选取的深层过滤膜面积偏小，不足以满足全部过滤完所有的细胞培养液，造成过滤膜的堵塞将影响工艺的进行，造成过滤后的细胞培养液浊度较高而影响下游柱层析的堵塞，且容易增加污染风险；若选取的膜面积过大，不能有效的利用膜面积，则会造成不必要的成本浪费。因此在对抗PD-1单克隆抗体细胞液采用深层过滤时，需要对过滤的参数进行优化研究，特别是中试以上规模的抗体生产中，成本的增加更需要合适的深层过滤工艺。
技术实现思路
本专利技术通过小试模拟深层过滤的过程，采用测试得到的数据拟合数学方程计算得到中试规模所需深层过滤膜的面积，并优化深层过滤工艺参数，得到中试规模深层过滤抗PD-1单克隆抗体细胞培养液的方法，该方法能够有效的抗PD-1单克隆抗体细胞培养液进行澄清过滤，能够有效利用膜面积，最大限度的减少深层过滤膜的浪费，适合中试规模的生产。本专利技术提供的中试规模深层过滤抗PD-1单克隆抗体细胞培养液的方法，其特征在于，所述细胞培养液细胞密度为100×105～400×105cell/mL，细胞活率为50％～90％，浊度为4000NTU～6000NTU，所述方法包含以下步骤：步骤1)深层过滤膜的组装：将深层过滤膜片组装至深层过滤器中，所述过滤膜片按过滤顺序先后为D0HC和A1HC两种型号；步骤2)预冲洗：采用注射用水对深层过滤膜进行预冲洗和润湿，注射用水预冲洗体积为50～150L/㎡，预冲洗通量为400～700LMH；步骤3)缓冲液平衡：采用缓冲液对深层过滤膜进行平衡，所述缓冲液为20mMNaPi缓冲溶液，pH为7.2，，平衡体积为20～50L/㎡，缓冲液平衡通量为400～700LMH；步骤4)过滤细胞培养液：用蠕动泵将发酵罐中的细胞培养液送至深层过滤器中过滤，过滤通量为50～180LMH，细胞液澄清过滤压力终点为12～22psi，过滤工艺时间为1～3小时；步骤5)冲膜回收：用步骤3)所述缓冲液对深层过滤膜进行冲洗并回收缓冲液，冲洗体积为20～50L/㎡，冲洗通量为50～180LMH。本专利技术所述抗PD-1单克隆抗体细胞培养液所用的细胞株为采用二氢叶酸还原酶缺陷型系统表达的抗PD-1单克隆抗体的基因重组CHO细胞。本专利技术采用的深层过滤膜型号D0HC和A1HC为默克密理博公司生产，采用的介质均为两层高密度的吸附介质，为带正电荷的硅藻土和纤维素膜，可高效的截留细胞污染物，提高截留载量。D0HC和A1HC的膜孔径分布范围分别为0.5～10μm和0.01～0.5μm，能有效保证细胞培养液澄清后的浊度。根据所需澄清过滤的细胞液的体积以及研究和生产需要，有测试级的过滤膜包和放大生产的膜片供使用，其中测试级的过滤膜包单个膜包的膜面积为23cm2，供放大生产的单个膜片的膜面积为1.1m2，使用时根据实际需要的膜面积进行膜片的叠加安装。本专利技术所述中试规模指体积为130～150L细胞培养液。由于抗体制备的成本昂贵，为了节约成本，本专利技术采用测试级的D0HC和A1HC过滤器进行深层过滤工艺研究，以获得最适合放大中试规模对抗PD-1抗体细胞液进行深层澄清过滤的工艺。首先将测试型号的膜面积均为23cm2的D0HC和A1HC过滤膜包，先后通过硅胶管组装一起。用注射用水冲洗深层过滤膜包，将膜包内空气全部赶出，充分润湿。为了得到注射水冲洗深层过滤膜的最佳通量以及冲洗体积，减少资源的浪费；本专利技术分别通过400LMH、500LMH、600LMH、700LMH四种不同的通量条件下用160L/㎡注射用水分别冲洗D0HC和A1HC深层过滤膜包，并在每隔20L/㎡分别记录每级的压力差，并绘制曲线(见图1和图2)，观察通量和冲洗体积之间的变化关系以及对膜压力的影响；从图1、图2的结果可知，在700LMH通量条件下，起始压力过高，故高通量不适合使用，注射水冲洗的通量优选500～600LMH。总有机碳(TOC)一般指存在于含水溶液中并测量为碳含量的有机分子的量度，在实际应用中TOC常常用于评价设备或容器的清洗干净程度，因此本专利技术用注射用水以600LMH通量预冲洗深层滤器，每冲洗10L/㎡时，分别在每级过滤器出口端取样，测定TOC的变化值，以得到最优的注射水冲洗体积(见图3)。从图3可知，当冲洗体积为90L/㎡时，两级深层过滤器的出口端收集液测得的TOC趋于稳定，小于2ppm，可认为本文档来自技高网...

【技术保护点】
中试规模深层过滤抗PD‑1单克隆抗体细胞培养液的方法，其特征在于，所述细胞培养液细胞密度为100×105～400×105cell/mL，细胞活率为50％～90％，浊度为4000NTU～6000NTU，所述方法包含以下步骤：步骤1)深层过滤膜的组装：将深层过滤膜片组装至深层过滤器中，所述过滤膜片按过滤顺序先后为D0HC和A1HC两种型号；步骤2)预冲洗：采用注射用水对深层过滤膜进行预冲洗和润湿，注射用水预冲洗体积为50～150L/㎡，预冲洗通量为400～700LMH；步骤3)缓冲液平衡：采用缓冲液对深层过滤膜进行平衡，所述缓冲液为20mM NaPi缓冲溶液，pH为7.2，，平衡体积为20～50L/㎡，缓冲液平衡通量为400～700LMH；步骤4)过滤细胞培养液：用蠕动泵将发酵罐中的细胞培养液送至深层过滤器中过滤，过滤通量为50～180LMH，细胞液澄清过滤压力终点为12～22psi，过滤工艺时间为1～3小时；步骤5)冲膜回收：用步骤3)所述缓冲液对深层过滤膜进行冲洗并回收缓冲液，冲洗体积为20～50L/㎡，冲洗通量为50～180LMH。

【技术特征摘要】
1.中试规模深层过滤抗PD-1单克隆抗体细胞培养液的方法，其特征在于，所述细胞培养液细胞密度为100×105～400×105cell/mL，细胞活率为50％～90％，浊度为4000NTU～6000NTU，所述方法包含以下步骤：步骤1)深层过滤膜的组装：将深层过滤膜片组装至深层过滤器中，所述过滤膜片按过滤顺序先后为D0HC和A1HC两种型号；步骤2)预冲洗：采用注射用水对深层过滤膜进行预冲洗和润湿，注射用水预冲洗体积为50～150L/㎡，预冲洗通量为400～700LMH；步骤3)缓冲液平衡：采用缓冲液对深层过滤膜进行平衡，所述缓冲液为20mMNaPi缓冲溶液，pH为7.2，，平衡体积为20～50L/㎡，缓冲液平衡通量为400～700LMH；步骤4)过滤细胞培养液：用蠕动泵将发酵罐中的细胞培养液送至深层过滤器中过滤，过滤通量为50～180LMH，细胞液澄清过滤压力终点为12～22psi，过滤工艺时间为1～3小时；步骤5)冲膜回收：用步骤3)所述缓冲液对深层过滤膜进行冲洗并回收缓冲液，冲洗体积为20～50L/㎡，冲洗通量为50～180LMH。2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓义熹，张铭生，李乐，蒙国基，于玉根，袁庆，
申请(专利权)人：深圳万乐药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44