【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物分析领域，具体涉及合成硼替佐米原料药的中间体中异戊胺杂质的检测方法。
技术介绍
1、硼替佐米是一种癌症治疗药物，是全球第一个合成的蛋白酶体抑制剂(proteasomeinhibitor)，可延缓、停止及治疗多发性骨髓瘤和被套细胞淋巴瘤恶化的情况，属于标靶治疗的新型抗癌药，2003年经fda批准上市，并于2008年6月被美国fda批准作为多发性骨髓瘤的一线治疗用药。该药物的发现曾获得医药界广泛关注，其作用机理获得2004年度诺贝尔化学奖，2006年获制药界最高荣誉—国际盖伦奖，被誉为“肿瘤治疗的革命，多发性骨髓瘤治疗的重大进步”。
2、硼替佐米化学名为[(1r)-3-甲基-1-[[(2s)-1-氧-3-苯基-2-[(呲嗪羧基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸，结构式如下：
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4、wo2009004350a1公开了硼替佐米的合成路线：
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6、从上述硼替佐米合成路线可看出，l-硼亮氨酸蒎烷二醇酯(简称tplm)是硼替佐米合成的重要中间体，可以作为合成硼替佐米原料药的起始物料，其质量的优劣将影响到硼替佐米最终产品的质量。其化学名为：(ar,3as,4s,6s,7ar)-六氢-3a,8,8-三甲基-alpha-(2-甲基丙基)-4,6-甲桥-1,3,2-苯并二氧硼烷-2-甲胺2,2,2-三氟乙酸盐。在tplm合成的最后一步脱三甲基硅烷保护基的反应过程中，可能会同时脱掉蒎烷二醇保护的硼酸基团，从而产生杂质异戊胺。
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8、国际人用药品
9、目前尚无关于硼替佐米中间体l-硼亮氨酸蒎烷二醇酯(tplm)中异戊胺含量控制方法的相关报道。文献“柱前衍生hplc法检测硼替佐米中间体中异戊胺盐酸盐，分析实验室，2022,40(9)”报道了硼替佐米中间体(r)-1-氨基-3-甲基丁基硼酸频那醇酯盐酸盐中异戊胺盐酸盐的柱前衍生hplc方法，该方法将硼替佐米中间体(r)-1-氨基-3-甲基丁基硼酸频那醇酯盐酸盐采用冰浴中先后加入二氯甲烷溶解，再依次加入三乙胺、苯甲酰氯的方法进行衍生化，采用甲醇定容，色谱条件采用c18色谱柱，流动相为甲醇-水，流速1.0ml/min，柱温35℃，检测波长236nm，进样量10μl。
10、为了获得高质量的tplm并进一步制备安全有效的硼替佐米原料药，有必要对tplm中的工艺杂质异戊胺的含量控制方法进行研究。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种硼替佐米中间体l-硼亮氨酸蒎烷二醇酯(tplm)中异戊胺杂质的检测方法，该方法操作简单，色谱峰出峰峰型好，主峰与杂质峰的分离度好，能准确有效的测定硼替佐米中间体tplm中异戊胺的含量，适用于tplm中工艺杂质异戊胺的质量控制。
2、本专利技术提供的硼替佐米中间体l-硼亮氨酸蒎烷二醇酯(tplm)中异戊胺杂质的检测方法，其特征在于，采用柱前衍生hplc方法进行检测，其中采用5％苯甲酰氯乙腈溶液作为衍生化溶液；hplc色谱条件中色谱柱采用c18键合硅胶色谱柱，流动相采用乙腈-水-甲酸混合溶液，通过变换流动相中乙腈和水的比例进行梯度洗脱。
3、从tplm及异戊胺的结构式可看出，tplm及异戊胺无发色团，在紫外下吸收很弱，无法直接通过hplc-uv法对其进行检测，需要采用柱前衍生的方法将两种物质进行衍生化成具有发色基团的物质再进行检测。本申请专利技术人在研究硼替佐米中间体tplm中异戊胺杂质检测方法时尝试使用文献“柱前衍生hplc法检测硼替佐米中间体中异戊胺盐酸盐，分析实验室，2022,40(9)”报道的衍生化方法时发现，tplm采用冰浴中加入二氯甲烷溶解，再加入三乙胺，滴加苯甲酰氯的方法进行衍生化时，会出现摇匀时溶液喷溅现象，即使采取冰浴以及缓慢滴加等措施防止喷溅，检测后回收率仍不合格。也尝试采用加入丙酮溶解，再依次加入三乙胺、苯甲酰氯的方法进行衍生化，但是检测图谱中基线不平稳，有较多杂质峰，丙酮峰会严重拖尾干扰异戊胺衍生物峰。而采用乙腈作为衍生化反应的溶剂，专利技术人也做了大量研究。实验发现，采用将样品用乙腈溶解后再依次加入三乙胺和苯甲酰氯的操作方法回收率还是不合格。经研究意外发现，采用将苯甲酰氯制备成一定浓度的苯甲酰氯乙腈溶液后与硼替佐米中间体tplm进行衍生化反应，同时将乙腈与水、甲酸组成的流动相溶液作为定容溶液能够取得较好结果，不存在操作中喷溅和基线不稳以及干扰目标峰的问题，且能够实现回收率合格。
4、专利技术人考察了不同浓度的苯甲酰氯乙腈溶液(2％苯甲酰氯乙腈溶液、5％苯甲酰氯乙腈溶液)分别作为衍生化试剂对衍生化结果的影响，试验结果显示采用2％苯甲酰氯乙腈溶液作为衍生化试剂后异戊胺衍生物回收率为59.9％，不符合要求。而采用5％苯甲酰氯乙腈溶液作为衍生化试剂异戊胺衍生物回收率能够达到100.2％，能够满足定量要求。
5、专利技术人还考察了不同衍生化时间对tplm衍生化结果的影响。实验过程中发现，若采用连续加入5％苯甲酰氯乙腈衍生化溶液和三乙胺，回收率不合格，必须将tplm与5％苯甲酰氯乙腈反应足够时间后再加入三乙胺，才能最终检测得到合格的回收率。分别考察tplm供试品中加入5％苯甲酰氯乙腈衍生化反应15min、30min、45min后再加入三乙胺反应10min两种衍生化方法的回收率，结果见下表：
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7、结果显示tplm加入5％苯甲酰氯乙腈衍生化反应45min后再加入三乙胺反应10min的才能衍生化反应完全，能够得到合格回收率。因此衍生化时间优选先加入5％苯甲酰氯乙腈衍生化反应至少45min，再加入三乙胺反应至少10分钟，总的衍生化反应时间至少为55分钟。
8、本专利技术所述高效液相色谱方法的色谱条件为色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料(waters symmetry c18，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱，柱温20～30℃，优选25℃；流速为0.9～1.1ml/min，优选1.0ml/min；检测波长为226nm，进样体积为10μl；流动相为乙腈、水与甲酸组成的混合液，通过变换流动相中乙腈和水的比例进行梯度洗脱，所述梯度洗脱具体梯度洗脱方法如下表：
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11、其中流动相a为乙腈-水-甲酸(体积比30：70：0.1)，流动相b为乙腈-水-甲酸(体积比80：20：0.1)。
12、本专利技术提供的硼替佐米中间体l-硼亮氨酸蒎烷二醇酯(tplm)中异戊胺的检测方法，具体包含以下操作步骤：
13、1)对照品溶液的制备：异戊胺用乙腈溶解并稀释制成0.5mg/ml的异戊胺母液；冰浴中于异戊胺母液中加入衍生本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.硼替佐米中间体L-硼亮氨酸蒎烷二醇酯中异戊胺杂质的检测方法，其特征在于，采用柱前衍生HPLC方法进行检测，其中衍生化方法采用5％苯甲酰氯乙腈溶液作为衍生化溶液；HPLC色谱条件中色谱柱采用C18键合硅胶色谱柱，流动相采用乙腈-水-甲酸混合溶液，通过变换流动相中乙腈和水的比例进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述衍生化方法采用将样品中先加入5％苯甲酰氯乙腈溶液衍生化反应至少45min，再加入三乙胺反应至少10分钟，总的衍生化反应时间至少为55分钟。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，色谱条件还包括柱温为20～30℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为226nm，进样体积为10μl。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，柱温为25℃，流速为1.0ml/min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体梯度洗脱方法如下表：
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，具体包含以下操作步骤：
【技术特征摘要】
1.硼替佐米中间体l-硼亮氨酸蒎烷二醇酯中异戊胺杂质的检测方法，其特征在于，采用柱前衍生hplc方法进行检测，其中衍生化方法采用5％苯甲酰氯乙腈溶液作为衍生化溶液；hplc色谱条件中色谱柱采用c18键合硅胶色谱柱，流动相采用乙腈-水-甲酸混合溶液，通过变换流动相中乙腈和水的比例进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述衍生化方法采用将样品中先加入5％苯甲酰氯乙腈溶液衍生化反应至少45min，再加入三乙胺反应至少10分钟，总的衍生化反...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴学文，钟剑，袁庆，于玉根，庄思敏，翟丽平，林嘉欢，
申请(专利权)人：深圳万乐药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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