一种利用皮肤成纤维细胞钾离子通道评价抗衰老功效的方法技术

本发明专利技术公开了一种对受试样品的抗衰老功效进行评价的方法，所述方法包括以下步骤：a)在细胞培养液中培养成纤维细胞，得到包含成纤维细胞的培养液；b)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到基线电流；c)将受试样品加入步骤a)的培养液中；d)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到加入受试样品之后的电流；e)将步骤b)的检测结果与步骤d)的检测结果进行比较，与基线电流相比电流升高则判定所述样品具有抗衰老功效。本发明专利技术还涉及对受试样品的抗衰老功效进行评价的装置。

【技术实现步骤摘要】
一种利用皮肤成纤维细胞钾离子通道评价抗衰老功效的方法
本专利技术涉及抗衰老领域一种新的评估方法，具体涉及一种通过膜片钳技术检测皮肤成纤维细胞钾离子通道来评价产品抗衰老功效的方法。本评估方法可以用于包括皮肤外用剂在内的化妆品、药品、食品的抗衰老功效评估领域。
技术介绍
抗衰老作为化妆品、食品、药品以及保健品等领域的一个重要研究课题，已经得到广泛关注，对于抗衰老的研究也日益深入，有关皮肤衰老的机理学说也多达十余种。近年来，最为常见的皮肤衰老的机理是自由基学说、基因学说、线粒体DNA损伤学说等等。皮肤衰老在表皮表现为表皮更新减慢、屏障功能减弱、角质形成细胞活力下降、表皮受伤后修复能力减弱。真皮衰老表现为真皮对外来化学物清除力下降，真皮厚度变薄、胶原蛋白和弹性蛋白合成减少、分解增加，分解酶活性增强。真皮厚度变薄，胶原含量减少，特别是可溶性胶原含量下降明显；胞外间质中透明质酸和硫酸皮肤素含量明显下降，糖胺多糖总含量下降。此外，胶原纤维和弹性纤维排列也渐趋紊乱。作为皮肤的一个重要组成部分和皮肤真皮中主要的细胞类型，成纤维细胞在调节皮肤生理和病理方面发挥关键作用，因为他们能够生产真皮组织的细胞外基质。此外，成纤维细胞之间不仅能够相互沟通还能够与皮肤中其他类型的细胞有联系。而且，成纤维细胞不仅积极参与刺激细胞的增殖和凋亡，也参与到创面修复，免疫反应和真皮的炎症过程中，因为他们能通过自分泌和旁分泌的相互作用释放多种生长因子和细胞因子。因此，调节成纤维细胞的增殖与抗皮肤衰老息息相关。目前现有技术中的针对抗衰老的体外评估方法中，比较广泛使用的方法有：DPPH自由基清除检测、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测、DNA损伤检测、成纤维细胞增殖等方法。现有技术的抗衰评估方法存在许多缺点，例如DPPH自由基清除检测法中，DPPH既是氧化剂又是自由基指示剂，当被测物与DPPH紫外吸收有交叠时，会影响测定结果。此外，DPPH的颜色虽然主要因单电子转移反应消除，但也可以由氢转移反应消除。由于空间位阻决定反应的倾向，因此小分子化合物由于更接近自由基而拥有相对较高的抗氧化能力。许多在体内与过氧自由基发生快速反应的抗氧化剂可能因空间位阻等原因不易与DPPH自由基反应。此外，大部分抗衰老评价方法，没有深入揭示抗衰老功效的机理，易引起假阳性结果，并需要多个实验组合，共同验证抗衰老功效，操作较复杂、成本较高。本专利技术是基于以下意外发现：抗衰老作用与成纤维细胞钾离子通道的开放有关。钾离子通道是细胞膜上允许K+流入或者流出细胞的离子通道蛋白。它也是目前发现亚型最多，功能最复杂的一类离子通道。钾离子通道具有很强的普遍性，分布广泛。它大范围地存在于机体的各种组织和器官中，如心脏、神经、血管、气管、皮肤和内分泌等细胞上都有钾离子通道的存在。钾离子通道具有较强的多样性，并且不同类型的钾离子通道都有各自特异性的阻断剂，比如：Apamin、Scyllatoxin和Curare可以阻断SK；而Clotrimazole则是中电导的钙激活钾离子通道的特异性阻断剂。钾离子通道不仅能够参与神经细胞膜静息电位的建立、决定其动作电位的发放频率和幅度，还与细胞的发育、成熟等有关，钾离子通道作为药物的靶点也正在广泛开展。因此，研究钾离子通道的调控以及在生物学功能中的作用和规律，不仅对于研发药物治疗钾离子通道疾病可提供临床指导价值，对于深入研究药物(添加剂)的功效也具有重要意义，但是对于钾离子通道的研究还未有涉及抗衰老领域。人皮肤成纤维细胞上的离子通道表达的研究第一次是由Estacion在1991年使用膜片钳技术进行诠释的。尽管人皮肤成纤维细胞被列为非兴奋性细胞，但是它能表达各种不同的离子通道的表型，包括电压门控外向延迟整流钾离子通道(IK),钙激活钾离子通道(IK(Ca))及A型瞬时外向钾离子通道(IA)。最近，Yun等人的研究表明三类功能性钙激活钾离子通道，大电导钙激活钾离子通道(BK)，中间电导钙激活钾离子通道(IK)及小电导钙激活钾离子通道(SK)，在人皮肤成纤维细胞中都有表达。然而，关于成纤维细胞拥有的离子通道类型、功能以及被调节的机制知之甚少。在研究皮肤成纤维细胞上的钾离子通道时，意外发现，现有技术中公认的抗衰老化合物白藜芦醇能够浓度依赖性地开放成纤维细胞钾离子通道。同时，早期的研究结果表明，白藜芦醇能够促进成纤维细胞增殖，显示其抗衰老功效，在加入钾离子通道特异性的阻断剂时，白藜芦醇不再促进成纤维细胞的增殖。因此得出结论，白藜芦醇促进成纤维细胞的增殖与钾离子通道的开放有关，即抗衰老作用与成纤维细胞钾离子通道的开放有关。专利技术人通过检测皮肤成纤维细胞的钾离子通道开放的方法，证实其与抗衰老功效的关系。采用本专利技术的方法来评价产品的抗衰老功效快速、准确、敏感、直观。该方法能够给大规模抗衰老功效原料筛选研究提供一项快速有效的评估手段。因此，本专利技术首次提出皮肤成纤维细胞的钾离子通道的开放与该细胞增殖相关，从而为抗衰老机理研究提供了一个新的方向。
技术实现思路
以下给出一个或多个方面的简要概述以提供对这些方面的基本理解。此概述不是所有构想到的方面的详尽综览，并且既非旨在指认出所有方面的关键性或决定性要素亦非试图界定任何或所有方面的范围。其唯一的目的是要以简化形式给出一个或多个方面的一些概念以为稍后给出的更加详细的描述之序。本专利技术以现有技术公认的抗衰老化合物白藜芦醇为样品，来验证本方法的可靠性、准确性、可重复性。白藜芦醇(Resveratrol,3,4',5-三羟基芪)是多酚类化合物，主要来源于葡萄、虎杖、花生等植物。白藜芦醇目前已经成为一个公认的具有抗衰老功效的物质，1998年美国艾尔·敏德尔编撰《抗衰老圣典》时，将白藜芦醇列为“100种最热门有效抗衰老物质”之一。大量证据证明白藜芦醇的抗衰老作用，它不仅可抑制脂质过氧化，还能抑制人体低密度脂蛋白(LDL)的氧化，减少H2O2的产生，起到抗氧化、抗自由基的作用。科学家们还发现白藜芦醇可以通过调节控制衰老基因的表达和模仿卡路里限制(CaloricRestriction，CR)的路径来抵抗衰老甚至延长寿命。同时体外的研究表明，白藜芦醇可以激活抗衰老基因SIRTl的表达。经本专利技术人研究发现，白藜芦醇能够促进成纤维细胞的增殖，而本领域众所周知的是，促进成纤维细胞增殖与抗衰老相关。本专利技术意外地发现，白藜芦醇促进成纤维细胞增殖的作用是通过开放细胞膜的钾离子通道而产生的。因此，本专利技术提供了一种对受试样品的抗衰老功效进行评价的方法，所述方法包括以下步骤：a)在细胞培养液中培养成纤维细胞，得到包含成纤维细胞的培养液；b)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到基线电流；c)将受试样品加入步骤a)的培养液中；d)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到加入受试样品之后的电流；e)将步骤b)的检测结果与步骤d)的检测结果进行比较，与基线电流相比电流升高则判定所述样品具有抗衰老功效。本专利技术所述基线电流即为实施例2-3中阴性对照组对应的皮肤成纤维细胞钾离子通道电流。在一个实施方式中，所述受试样品可以是任何样品，包括：食品、药品和/或化妆品。在一个具体的实施方式中，所述步骤e)中的电流升高包括与基线电流相比电流升高至少大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对受试样品的进行抗衰老功效评价的方法，所述方法包括以下步骤：a)在细胞培养液中培养成纤维细胞，得到成纤维细胞；b)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到基线电流；c)将受试样品加入步骤a)的成纤维细胞中；d)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到加入受试样品之后的电流；e)将步骤b)的检测结果与步骤d)的检测结果进行比较，与基线电流相比电流升高则判定所述样品具有抗衰老功效。

【技术特征摘要】
1.一种对受试样品的进行抗衰老功效评价的方法，所述方法包括以下步骤：a)在细胞培养液中培养成纤维细胞，得到成纤维细胞；b)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到基线电流；c)将受试样品加入步骤a)的成纤维细胞中；d)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到加入受试样品之后的电流；e)将步骤b)的检测结果与步骤d)的检测结果进行比较，与基线电流相比电流升高则判定所述样品具有抗衰老功效。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受试样品包括：食品、药品和/或化妆品。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e)中的电流升高包括与基线电流相比电流升高至少大于100％。4.一种对受试样品的抗衰老功效进行评价的装置，包括：细...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯冰，魏少敏，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：上海家化联合股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31