体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法，筛选步骤为：取对数生长期的星形胶质细胞，接种于24孔板，培养24 h；待星形胶质细胞生长至孔板的80‑90 %后吸走星形胶质细胞原培养液，加入待筛选的牡蛎活性肽作用于星形胶质细胞；24 h后再次吸走培养液，向星形胶质细胞中加入磷酸缓冲液，充分研磨星形胶质细胞，离心，取上清液测定乙酰胆碱酯酶（AchE）活力，根据AchE活力的大小，筛选出对AchE抑制率最高的牡蛎活性肽。本发明专利技术选用哺乳动物脑内分布最广泛的星形胶质细胞为模型，更直接、更准确的提取AchE用于牡蛎活性肽的体外活性筛选。

【技术实现步骤摘要】
体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法。
技术介绍
随着现代生活节奏的加快以及学习、工作压力的增加，学习记忆及认知功能衰退等亚健康问题日益严重，因此，研究开发具有缓解人体精神压力，改善和提高学习记忆能力的天然活性物质具有重要意义。乙酰胆碱酯酶(AchE)是生物神经传导中的一种关键性的酶，主要存在于神经肌肉接头与胆碱能神经系统中，其主要生理功能是将胆碱能突触间隙内的神经递质水解为乙酸和胆碱，终止兴奋刺激作用。目前判断活性物质改善记忆力的体外筛选方法是通过测定抑制AchE的活性来评价。传统方法是将AchE酶液、样品、显色剂和底物孵育一定时间，加入SDS终止反应并测定吸光值，计算样品对AchE的抑制率。然而市售的高纯度的AchE价格昂贵，不适用于样品的初期大量筛选。另一种测定方法是使用AchE试剂盒，然而该方法只适用于新鲜的样本组织，对于冷冻干燥的样品具有一定的局限性。有部分研究集中在AchE的提取和纯化方面，申请号：201210144988X专利名称：一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法，公开了一种AchE的制备方法：将蚯蚓在冰水浴下用磷酸缓冲溶液匀浆，离心得粗酶提取液，加入表面活性剂TritonX-114溶液和柠檬酸缓冲溶液定容到10mL，35℃水浴平衡9min，离心取下层，即为纯化后AchE制品。该方法操作简便，成本低，然而AchE的活性在纯化过程中是否发生变化则未有明确报道，另外，该AchE制品的来源与人体差异较大，也值得进一步研究和应用。在人体中枢神经系统内，胶质细胞的数量几乎占90％，而星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大的一种，现已证实星形胶质细胞在中枢神经系统的发育及病理生理过程中起重要作用，它还具有灭活和供给神经递质，抑制神经元过度兴奋的作用，参与学习和记忆等脑的高级功能活动。因此，综合考虑AchE的贮存条件和来源性，本专利技术通过培养星形胶质细胞并从该细胞中提取AchE来进行牡蛎活性肽的体外活性筛选。牡蛎是一种著名的海产贝类，在我国沿海均有生长，牡蛎含有丰富的糖原、蛋白质、氨基酸、微量元素锌及维生素等，除食用外，牡蛎还是一种传统的海洋中药材，有“清热除湿、化痰软坚、止心脾气痛”等功效，其作为治病强身的海洋药物，吸引越来越多研究者的关注。随着现代医学的深入研究，发现牡蛎具有多种生物活性，如抗菌、抗氧化、降血压、抗肿瘤、提高机体免疫力、防衰老、对心血管具有保护作用等活性，但关于其在改善记忆力方面的研究鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法。本专利技术实现目的的方案如下：体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法，其特征在于，筛选步骤为：(1)取对数生长期的星形胶质细胞，接种于24孔板，培养24h；(2)待星形胶质细胞生长至孔板的80-90％后吸走星形胶质细胞原培养液，加入待筛选的牡蛎活性肽作用于星形胶质细胞24h；(3)24h后再次吸走培养液，向星形胶质细胞中加入磷酸缓冲液，充分研磨星形胶质细胞，离心，取上清液测定AchE活力，根据AchE活力的大小，筛选出对AchE抑制率最高的牡蛎活性肽。优选的；步骤(1)中所述星形胶质细胞接种密度为1×105～106个/mL，接种量为0.5～1.0mL。优选的；步骤(2)中所述牡蛎活性肽浓度为10mg/mL，体积为0.5～1.0mL。优选的；步骤(2)中所述牡蛎活性肽的制备方法为：取新鲜牡蛎，匀浆，按液固比1～3:1的比例加入去离子水，在45℃水浴中搅拌均匀，按照牡蛎与复合蛋白酶的质量比1000:8～16加入复合蛋白酶(1.0×105U/g)，调节pH至7～8，保温3～10min后在45～65℃下酶解3～7h，酶解结束后，取酶解液于95～100℃加热10min钝化灭酶，直至酶解反应结束，离心，取上清液，冷冻干燥即得牡蛎活性肽冻干品。优选的；步骤(3)中所述的磷酸缓冲液体积为0.5～1.0mL，pH为7.2～7.4，浓度为0.01M。优选的；步骤(3)中所述的离心条件为：4℃环境下5000～8000r/min离心10～15min。优选的；步骤(3)中所述上清液体积为0.4～0.5mL。本专利技术的有益效果：本专利技术选用哺乳动物脑内分布最广泛的星形胶质细胞为模型，更直接、更准确的从星形胶质细胞中提取AchE用于牡蛎活性肽的体外活性筛选。此外，首次从基因水平分析牡蛎活性肽改善记忆力的作用机制，为实现海洋贝类高值化利用提供新的思路。附图说明图1为小鼠训练第5天，各组之间小鼠的游泳路线差异；图2为各组间小鼠游泳路程的差异；图3为各组间小鼠进入暗室潜伏期的差异；图4为各组之间AchE和ChAT活力的差异；图5为各组之间BDNF和NCAM含量的差异。备注：图2-图5中，不同字母代表各组之间存在显著性差异(P<0.05)，差异从小到大依次为a、ab、b、c。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1牡蛎活性肽的制备：分别取10份新鲜牡蛎各10g，匀浆，按液固比1～3:1的比例加入去离子水，在45℃水浴中搅拌均匀，按照牡蛎与复合蛋白酶的质量比1000:8～16加入复合蛋白酶(1.0×105U/g，索莱宝科技有限公司)，调节pH至7～8，保温5min后在45～65℃下酶解3～7h，酶解结束后，取酶解液于95～100℃加热10min钝化灭酶，直至酶解反应结束，离心，取上清液，冷冻干燥即得10种牡蛎活性肽，将各牡蛎活性肽样品按酶解条件不同分别编号为牡蛎活性肽1-10。各牡蛎活性肽样品具体酶解条件见表1。表1牡蛎活性肽酶解条件实施例2体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽：分别取对数生长期的星形胶质细胞10份(编号为星形胶质细胞1-10)，接种于24孔板，接种密度1×105个/mL，接种量0.5mL，培养24h，待星形胶质细胞生长至孔板的80％后吸走星形胶质细胞原培养液，依次加入实施例1中1-10号牡蛎活性肽(0.5mL，10mg/mL)作用于星形胶质细胞，24h后再次吸走培养液，分别向10份星形胶质细胞中加入0.5ml磷酸缓冲液(0.01M，pH为7.2)，充分研磨星形胶质细胞，4℃环境下5000r/min离心10min，取上清液0.4mL，使用AchE测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：A024，检测方法参考说明书)测定其AchE的活力，筛选出对AchE抑制率最高的牡蛎活性肽。星形胶质细胞1-10号中的AchE活力见表2。表2乙酰胆碱酯酶(AchE)活力从表2中可知：经牡蛎活性肽10号作用的星形胶质细胞中的AchE活力最低，为0.417U/mL，因此实施例1中的牡蛎活性肽10号的AchE抑制率最高。实施例3体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽：分别取对数生长期的星形胶质细胞10份(编号为星形胶质细胞1-10)，接种于24孔板，接种密度1×106个/mL，接种量0.5mL，培养24h，待星形胶质细胞生长至孔板的90％后吸走星形胶质细胞原培养液，依次加入实施例1中1-10号牡蛎活性肽(0.5mL，10mg/mL)作用于星形胶质细胞，24h后再次吸走培养液，分别向10份星形胶质细胞中加入1.0mL磷酸缓冲液(0.01M，pH为7本文档来自技高网...

【技术保护点】
体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法，其特征在于，筛选步骤为：（1）取对数生长期的星形胶质细胞，接种于24孔板，培养24 h；（2）待星形胶质细胞生长至孔板的80‑90 %后吸走星形胶质细胞原培养液，加入待筛选的牡蛎活性肽作用于星形胶质细胞24h；（3）24 h后再次吸走培养液，向星形胶质细胞中加入磷酸缓冲液，充分研磨星形胶质细胞，离心，取上清液测定乙酰胆碱酯酶（AchE）活力，根据AchE活力的大小，筛选出对AchE抑制率最高的牡蛎活性肽。

【技术特征摘要】
1.体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法，其特征在于，筛选步骤为：（1）取对数生长期的星形胶质细胞，接种于24孔板，培养24h；（2）待星形胶质细胞生长至孔板的80-90%后吸走星形胶质细胞原培养液，加入待筛选的牡蛎活性肽作用于星形胶质细胞24h；（3）24h后再次吸走培养液，向星形胶质细胞中加入磷酸缓冲液，充分研磨星形胶质细胞，离心，取上清液测定乙酰胆碱酯酶（AchE）活力，根据AchE活力的大小，筛选出对AchE抑制率最高的牡蛎活性肽。2.根据权利要求1所述的体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法，其特征在于：步骤（1）中所述星形胶质细胞接种密度为1×105~106个/mL，接种量为0.5~1.0mL。3.根据权利要求1所述的体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法，其特征在于：步骤（2）中所述牡蛎活性肽浓度为10mg/mL，体积为0.5~1.0mL。4.根据权利要求1或3所述的体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法，其特征在于：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雪芹，于华华，邢荣娥，刘松，陈晓琳，李荣锋，李鹏程，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37