一种用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型建立技术

本发明专利技术公开了一种用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型建立，包括如下步骤：首先进行细胞培养，对细胞进行不同时间点给药后收样，制备细胞亚结构提取物；对提取物进行蛋白定量和紫杉醇含量检测；最后通过分析紫杉醇含量和蛋白定量的比值，筛选出合适的给药时间及紫杉醇浓度，建立检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型。本发明专利技术所涉及的细胞/亚细胞水平药代动力学可以更加准确的反映药物在作用靶点上的浓度，即紫杉醇在细胞微管的结合分布水平，直观的反映紫杉醇的药效。本发明专利技术可应用于考察另一种化合物是否能够影响紫杉醇的细胞药动学过程，即紫杉醇分布于细胞骨架的浓度是否提高，对于提高紫杉醇生物利用度具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型建立
本专利技术属于药物筛选模型建立
更具体地，涉及一种用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型建立，可应用于考察另一种化合物是否能够影响紫杉醇的细胞药动学过程，即其分布于细胞骨架的浓度是否提高。
技术介绍
药物代谢动力学是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢、排泄规律的一门学科，贯穿于新药发现、临床前研究的整个过程。在药物研发过程中，药效差、毒性强以及药动学性质不理想是淘汰候选化合物的三个主要原因。相关调查显示，国际上临床研究淘汰的药物中，近50%研发失败的药物是由于其疗效不佳，而另约40%候选化合物最终不能进入临床研究是因为其药物代谢动力学特征不理想。经典药物代谢动力学理论是建立在血浆药物浓度测定的基础上，认为血浆药物浓度与药效成正比，并通过建立房室模型等数学模型，求算相应的药代动力学参数后，描述或预测药物的体内过程。然而，越来越多的研究发现基于血浆药物浓度的经典药代动力学研究并不能完全解释药物在一些特定组织（如肿瘤、脑组织）中的药理学作用，常难以准确有效地预测体内药物的药效，出现药动学/药效学不相关的问题。目前已知很多药物的靶点位于细胞内，包括DNA、核受体、各种激酶、代谢酶等，所以这些药物必须穿过多重生物屏障，才能发挥药效。细胞内药物的处置过程及药物与靶点的结合是药物治疗效果的决定因素。因此，针对这些靶点位于细胞内的药物，研究其细胞/亚细胞器内的药物浓度比研究血浆药物浓度具有更重要的意义。紫杉醇（PTX）作为广谱抗癌药，自1992年美国FDA批准上市以来，已广泛应用于某些常见恶性肿瘤，如非小细胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌等。紫杉醇通过结合到微管蛋白，稳定微管聚合体，抑制微管解聚，抑制有丝分裂，从而抑制细胞分裂增殖。紫杉醇在细胞内起效，组织分布具有可饱和性，呈现非线性药代动力学特征。因此，测定血浆中紫杉醇的浓度不能准确反映药物在靶组织的浓度。此外，紫杉醇在靶组织浓度与细胞内浓度不相关。紫杉醇在细胞亚结构单位上的分布可以反映它结合到微管的能力，因此在亚细胞水平研究紫杉醇的分布很有意义。目前，在亚细胞水平定量紫杉醇具有难度，因为在治疗相关剂量下，紫杉醇在细胞隔室中浓度低。目前，已有报道使用LC-MS/MS方法，测定用一定浓度紫杉醇孵育后的A549细胞隔室中紫杉醇的浓度。但是，该方法并未筛选出适当的孵育时间及孵育浓度，仅用于测定细胞隔室中紫杉醇浓度，不能有效地筛选出能够促进紫杉醇与微观结合的化合物。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法，以及其筛选模型的建立。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型建立，包括如下步骤：S1.细胞培养；S2.对步骤S1的细胞进行不同时间点给药后收样；S3.对步骤S2收样得到的细胞进行细胞亚结构提取物的制备；S4.对步骤S3得到的提取物进行蛋白定量；S5.检测步骤S3得到的提取物的紫杉醇含量；S6.通过分析紫杉醇含量和蛋白定量的比值，筛选出合适的给药时间及紫杉醇浓度，建立检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型。从而应用于考察另一种化合物是否能够影响紫杉醇的细胞药动学过程，即其分布于细胞骨架的浓度是否提高。其中，优选地，步骤S1所述细胞培养为：取对数生长期细胞接种至细胞培养皿中，连续培养。优选地，步骤S2是对S1连续培养过程中的细胞进行不同时间点给药后收样处理。优选地，步骤S3步骤S3进行细胞亚结构提取物的制备时，根据细胞膜/细胞器、细胞质、细胞骨架、细胞核的蛋白溶解性不同，从细胞中提取不同细胞蛋白；且细胞贴壁培养，在提取细胞不同部分的过程中细胞依旧贴壁，防止提取过程中四部分混合。具体地，是利用ProteoExtract®SubcellularProteomeExtactionKit试剂盒进行细胞亚结构提取物的制备。优选地，步骤S4是利用BCA蛋白定量分析试剂盒对步骤S3得到的提取物进行蛋白定量。优选地，步骤S5是利用UPLC-MS/MS方法检测步骤S3得到的提取物的紫杉醇含量。其中所述UPLC-MS/MS方法的具体步骤为：首先配制紫杉醇标准系列溶液和内标多西紫杉醇工作溶液，然后待测样本经过预处理后，上样进行UPLC-MS/MS分析。UPLC-MS/MS的条件为：使用超高效液相-串联四极杆质谱的SRM模式测定。UPLC-MS/MS分析时，是以WatersACQUITYUPLCTMBEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)色谱柱进行分离。UPLC-MS/MS分析时，以甲醇：0.1%甲酸(80：20，v/v)流动相进等度洗脱。所述待测样本的预处理方法为：待测样本100μL，加入10μL内标多西紫杉醇工作溶液，涡旋10s混匀，加入叔丁基甲醚400μL，涡旋1min，室温静置5min，然后14000rpm4℃离心5min，吸取有机层，室温下通风挥干，加入100μL10mM醋酸铵：甲醇（1：1，v/v）溶液溶解，涡旋1min，14000rpm，4℃，离心5min，取上清液。上清液80μL置进样瓶中，10μL上样分析。本文应用UPLC-MS/MS方法，具有很高的灵敏度，可以用于测定低浓度的紫杉醇，测定了用一定浓度紫杉醇处理后A549细胞隔室中紫杉醇的浓度。另外，优选地，步骤S1所述细胞为非小细胞肺癌A549细胞株。本专利技术所筛选出来的最适给药时间为：5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h。即连续培养72h后的给药时间，即分别在给药5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h后收样。本专利技术所筛选出来的最适紫杉醇浓度为0.1μg/mL。本专利技术可应用于考察另一种化合物是否能够影响紫杉醇的细胞药动学过程，即考察某化合物是否能够影响紫杉醇分布于细胞骨架的浓度，具体的方法为：细胞培养72h后，分别进行两种给药方式：（1）0.1μg/mL紫杉醇，（2）0.1μg/mL紫杉醇和10μg/mL某化合物；然后按照不同时间点5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h，同一时间收样处理，进行细胞亚结构提取物的制备，进行UPLC-MS/MS分析紫杉醇含量，利用0.1μg/mL紫杉醇和10μg/mL某化合物处理后紫杉醇在细胞亚结构提取物中随时间分布变化图与单独给药0.1μg/mL紫杉醇处理后紫杉醇在细胞亚结构提取物中随时间分布变化图相比较，分析紫杉醇在细胞骨架的分布有无提高，即可说明待测某化合物是否可提高紫杉醇在细胞骨架的分布。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术所涉及的细胞/亚细胞水平药代动力学可以更加准确的反映药物在作用靶点上的浓度，即紫杉醇在细胞微管的结合分布水平，直观的反映紫杉醇的药效。本专利技术可用于考察另一种化合物是否能够影响紫杉醇的细胞药动学过程，即其分布于细胞骨架的浓度是否提高。对于提高紫杉醇生物利用度具有重要意义。筛选方法简单，易于操作。附图说明图1是A549细胞用0.5μg/mLPTX处理后各细胞亚结构中紫杉醇浓度的变化图。图2是A549细胞用0.01μg/mLPTX处理后在四部分提取物中随时间分布变化图。图3是A549细胞用0.1μg/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1. 细胞培养；S2. 对步骤S1的细胞进行不同时间点给药后收样；S3. 对步骤S2收样得到的细胞进行细胞亚结构提取物的制备；S4. 对步骤S3得到的提取物进行蛋白定量；S5. 检测步骤S3得到的提取物的紫杉醇含量；S6. 通过分析紫杉醇含量和蛋白定量的比值，筛选出合适的给药时间及紫杉醇浓度，建立检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.细胞培养；S2.对步骤S1的细胞进行不同时间点给药后收样；S3.对步骤S2收样得到的细胞进行细胞亚结构提取物的制备；S4.对步骤S3得到的提取物进行蛋白定量；S5.检测步骤S3得到的提取物的紫杉醇含量；S6.通过分析紫杉醇含量和蛋白定量的比值，筛选出合适的给药时间及紫杉醇浓度，建立检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型。2.根据权利要求1所述的用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型的建立方法，其特征在于，步骤S1所述细胞培养为：取对数生长期细胞接种至细胞培养皿中，连续培养。3.根据权利要求1所述的用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型的建立方法，其特征在于，步骤S2是对S1连续培养过程中的细胞进行不同时间点给药后收样处理。4.根据权利要求1所述的用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型的建立方法，步骤S3进行细胞亚结构提取物的制备时，根据细胞膜/细胞器、细胞质、细胞骨架、细胞核的蛋白溶解性不同，从细胞中提取不同细胞蛋白；且细胞贴壁培养，在提取细胞不同部分的过程中细胞依旧贴壁，防止提取过程中四部分混合。5.根据权利要求1所述的用于检测紫杉醇亚细胞分布动力学的方法及模型的建立方法，其特征在于，步骤S4是利用BCA蛋白定量分析试剂盒对步骤S3得到的提取物进行蛋白定量。6.根据权利要求1所述的用于检测紫杉醇亚细胞分布...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晶，黄民，蔡珮蘅，徐春草，苟晓莉，余伟邦，洪伟鹏，
申请(专利权)人：中山大学，广州中大南沙科技创新产业园有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44