一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法。该制备方法包括以下步骤：(1)合成包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的抗原合成肽；(2)利用步骤(1)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。本发明专利技术的人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体可用于检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体及其制备
，具体涉及一种特异性针对人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
NOTCH信号是一个在进化过程中高度保守的信号通路，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物的多个物种之中，它是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一，调控了多细胞机体的细胞凋亡、增殖和分化。从果蝇到人类，NOTCH信号途径的遗传特征高度保守，而在哺乳动物中其过程尤为复杂。NOTCH受体、NOTCH配体和细胞内效应分子CSL共同组成NOTCH信号通路。NOTCH受体为单链跨膜蛋白，其分子由胞外区(ECN)、跨膜区和胞内区(NICD)组成，具有高度保守性(参见图1)。目前哺乳动物中发现4种NOTCH基因(NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3，NOTCH4)，各亚型的主要差异在EGF样重复的数目和胞内区的长度。NOTCH配体亦为细胞表面表达的单链跨膜蛋白，已发现人的NOTCH配体有Jagged1，Jagged2，Delta1，Delta3，Delta4。NOTCH信号蛋白受体与配体相互作用导致NOTCH蛋白连续裂解，释放出胞内段蛋白(NICD)，NOTCH1NICD转入细胞核内，通过与CBF1/Su(H)/LAG1(CSL)相互作用形成复合物，使后者由转录抑制因子转化为转录激活因子。NICD-CBF1/Su(H)/LAG1(CSL)复合物直接诱导转录的靶基因是HES1，HES1是碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)类转录因子，它又调节其它与细胞分化直接相关基因的转录。在细胞分化中，NOTCH信号的功能有以下几个方面：①参与胚胎发育；②参与T细胞发育；③维持造血干细胞的自我更新；④调节血管生成。NOTCH1信号途径参与细胞的分化、增值和凋亡，并影响许多器官的发育和功能，其病理生理改变与肿瘤、血液系统、心血管系统、干细胞等多种疾病相关。研究表明：在肿瘤的发生和发展过程中，NOTCH1信号通路发挥着不同的作用；在大多数恶性肿瘤中，NOTCH1信号主要为促癌作用，活化的NOTCH1蛋白可使细胞恶性转化发展为肿瘤，如在宫颈癌、头颈肿瘤、肾癌及多种血液系统肿瘤中均发现NOTCH1的异常表达；NOTCH1信号的紊乱会阻止细胞分化，使得未分化细胞向恶性转化；而在B细胞白血病等肿瘤中，NOTCH1则可以抑制细胞生长诱导凋亡。在宫颈癌的早期，NOTCH1信号起促癌作用，晚期则起抑癌作用。这表明NOTCH1在不同肿瘤和肿瘤的不同阶段中，其发挥的作用也不尽相同。此外，由于NOTCH1信号通路可能作为多条通路的重要交汇点，NOTCH1信号的异常不仅对肿瘤的发生有直接的作用，而且能通过对其他通路的影响间接地诱导肿瘤的发生。磷酸化、泛素化等翻译后修饰在NOTCH信号通路介导的生理和病理过程中发挥着关键作用。细胞中NOTCH1NICD蛋白的降解对于NOTCH1信号通路的精准调控具有非常重要的意义，其半衰期主要由泛素化修饰和蛋白酶体介导的降解进行调节。已有研究表明：NOTCH蛋白泛素化修饰的前提条件是NOTCH1NICD蛋白必须进行磷酸化修饰。若NOTCH1NICD蛋白磷酸化修饰发生异常，将造成半衰期的延长而导致白血病和其它癌症的发生。因此，NOTCH1NICD蛋白的磷酸化修饰在NOTCH1信号通路的调控中扮演着重要角色。此外，已有证据表明：NOTCH1蛋白的磷酸化修饰可依赖于GSK-3β激酶，而GSK-3β激酶在Wnt-1信号通路中亦发挥重要的生物学功能，因此NOTCH信号通路与Wnt-1信号通路存在交叉反应。NOTCH1蛋白的持续活化对Wnt-1信号通路将产生一定的影响，从而导致细胞的致癌性转化。NOTCH1氨基酸序列中Ser2162位点位于NOTCH的胞内段序列区，是NOTCH1NICD蛋白磷酸化修饰的一个位点，在NOTCH1NICD蛋白降解失活的动态调控中可能具有重要的作用。抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床应用中，磷酸化抗体的制备和应用已成为国际上关注的热点。
技术实现思路
本专利技术目的在于解决在NOTCH1信号通路中发挥重要作用的NICD蛋白磷酸化修饰有效研究的问题，NOTCH1NICD蛋白发挥作用的首要条件是进行翻译后修饰作用，如磷酸化修饰。为此本专利技术提供一种特异性针对人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备方法。本专利技术提供的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备方法可以包括以下步骤：(1)合成包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的抗原合成肽；(2)利用步骤(1)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。上述步骤(1)中所述的抗原合成肽可以通过以下步骤合成：以人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的合成肽，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸Ser2162上添加磷酸化基团，同时在N末端连接一个半胱氨酸与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)进行偶联。上述步骤(2)中所述的免疫动物的步骤可以包括：用上述步骤(1)合成的抗原合成肽与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射。上述步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤可以包括：将上述步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对目的合成肽的效价及其是否能够特异性识别目的合成肽，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以Dotblot和Westernblot实验确定抗血清是否能够特异性识别磷酸化NOTCH1NICD蛋白。上述利用亲和分离‐亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的步骤可以包括：采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离及亲和纯化；首次采用非磷酸化合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；接着使用磷酸化合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的抗原合成肽；(2)利用步骤(1)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。

【技术特征摘要】
1.一种人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备方
法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的抗原合成
肽；
(2)利用步骤(1)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；
(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人NOTCH1
NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所
述的抗原合成肽通过以下步骤合成：以人NOTCH1NICD蛋白Ser2162
位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计氨基酸序列如SEQIDNO：1
所示的合成肽，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸Ser2162上添
加磷酸化基团，同时在N末端连接一个半胱氨酸与载体蛋白血蓝蛋白
或牛血清白蛋白进行偶联。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所
述的免疫动物的步骤包括：用步骤(1)合成的抗原合成肽与佐剂联合
免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位
两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，
爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强
注射和最后一次抗原直接注射。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所
述的纯化和鉴定的步骤包括：将步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验
测定抗血清针对目的合成肽的效价及其是否能够特异性识别目的合成
肽，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以Dotblot
和Westernblot...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁云山，邱晓媚，李妍，
申请(专利权)人：南方医科大学，珠海南医大生物医药公共服务平台有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44