本发明专利技术属于医学中的免疫学领域，特别涉及降钙素原B细胞表位肽及其单克隆抗体的应用，所述表位肽段如SEQ?ID?NO:3所示，其可用于制备杂交瘤细胞并分泌相应的单克隆抗体；该单克隆抗体可用于制备检测降钙素原的诊断试剂；本单克隆抗体具有纯度高>96%，效价高达1：1024000，且特异性好、可大批量制备等优点；通过本发明专利技术制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人血液降钙素原含量的检测，如可采用双抗体夹心ELISA反应模式，即酶标记人抗PCT单抗、酶标板包被抗PCT多抗和被测样品PCT抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫分析医学领域，特别涉及细胞表位肽段抗原及其单克隆抗体的应用。
技术介绍
细菌性感染只要能够早期发现、早期诊断、针对性的早期治疗，大多预后良好。否贝lj，可能发展成为重度菌血症或/和严重脓毒症。根据美国CDC的报告，目前脓毒症已经成为非心脏ICU死亡的主要原因OV Engl J Med. 2003;348: 1546-1554),因此感染性炎症的早期诊断极为重要。另外，随着细菌耐药性、重症感染患者的増加，如何指导临床用药也显得愈发重要。·降I丐素原(procalcitonin, PCT)是上世纪九十年代才发现的细菌、真菌性感染的特异性标志物，是ー种无激素活性的降钙素前肽，有116个氨基酸组成，I 57为N-残端，60 91为降钙素，96 116为降钙蛋白。分子量为13kD，由位于11号染色体(11ρ1514)上的CALC-I基因编码，半衰期为25 30小时，在体内外稳定性好，不会降解为降钙素，亦不受体内激素水平的影响，实验室检测快速简便，有利于临床特别是急诊广泛开展应用。在严重全身性细菌、真菌、寄生虫、急性疟疾感染、系统炎性反应综合症(SIRS)、多器官功能衰竭综合症(MODS)的诊断方面，PCT是ー个具有高灵敏度、特异性的新指标。PCT主要是在细菌毒素和炎性细胞因子的刺激下产生，而在非感染性炎症状态下血清PCT —般不升高，感染性炎症过程中，PCT的生成非常快，对内毒素刺激反应2 6小时内即升高，严重全身感染者血PCT在24 h内可升高达1000倍。PCT作为ー种新的感染性炎性标志物目前已被广泛认可。不仅能早期鉴别细菌与非细菌感染，更是败血症的预警和诊断指标，且PCT与细菌感染的程度成正相关，它的上升或下降直接反应疾病恶化或好转的趋势，因此，PCT的检测在细菌性感染、败血症、MODS的鉴别诊断、预后判断、疗效观察及合理指导应用抗菌药等均有重要參考价值。现有技术对PCT的制备方法多直接取自组织细胞，如甲状旁腺组织，成本高，制备过程复杂，获得产品量低，制约了对PCT的研究及应用开发。利用基因工程方法制备PCT重组蛋白是ー种简单、经济、可靠的方法，可大量制备PCT蛋白，并且在此基础上可进ー步制备抗PCT抗体，以进行PCT免疫检测。免疫检测的首要关键问题是如何获得特异性针对PCT的抗体，而且最好获得针对不同抗原决定簇的特异性抗体，所以进行预测选择PCT的B细胞免疫表位尤为重要。目前还没有相应的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的之ー在于提供降钙素原B细胞表位肽段及其衍生物及其衍生物，其能作为降钙素原单克隆抗体的抗原。本专利技术的目的之ニ在于提供一种杂交瘤细胞，其能特异性的分泌降钙素原单克隆抗体。同时，本专利技术还提供所述ー种单克隆抗体，其可作为加检测降钙素原的试剂。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为 I、降钙素原B细胞表位肽段，降钙素原B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。2、含有I所述的降钙素原B细胞表位肽段的衍生物，所述的降钙素原B细胞表位肽段的衍生物为所述降钙素原B细胞表位肽段偶联有载体蛋白BSA或KLH。3、根据2所述的的降钙素原B细胞表位肽段的衍生物，所述的降钙素原B细胞表位肽段在N末端引入半胱氨酸。4、1-3任一项所述的降钙素原B细胞表位肽段制备的单克隆抗体杂交瘤细胞。5、根据4所述的单克隆抗体杂交瘤细胞，单克隆抗体的杂交瘤细胞的生物保藏号为 CCTCC NO C201136o 6、5所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。本专利技术的目的还在于提供上述单克隆抗体的制备方法，该方法操作简单，适用于大规模生产该单克隆抗体。为实现上述目的，本专利技术的技术方案在于 所述的单克隆抗体的制备方法用如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的降钙素原B细胞表位肽段为抗原，免疫所得的血清效价大于1:3200的动物的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌得单克隆抗体。本专利技术的另一目的在于提供所述单克隆抗体的应用，该应用为检测降钙素原提供了新思路。为实现上述目的，本专利技术的技术方案在于 所述的单克隆抗体在制备用于检测降钙素原的诊断试剂中的应用。进一步，所述单克隆抗体与PCT重组蛋白的特异性多克隆抗体联合用于制备检测降钙素原的诊断试剂中的应用。进一步，所述PCT重组蛋白为如SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列所编码的蛋白。本专利技术的有益效果在于本专利技术制备的人降钙素原是高纯度的PCT重组蛋白(rhPCT)，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立PCT定量检测时的校准品； 通过PCT蛋白序列的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度>96%)、效价高(ELISA效价达I :1024000)、特异性好、可大批量制备等优点； 人PCT蛋白中B细胞表位肽段化学合成时在其N端引入半胱氨酸，提高了其与KLH或BSA交联率(>50%)，可获得优质免疫原； 通过本专利技术制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人血液PCT含量的检测，如可采用“双抗体夹心ELISA反应模式，即酶标记人抗PCT单抗、酶标板包被抗PCT多抗和被测样品PCT抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。附图说明图I为抗PCT单克隆抗体的纯化色谱图，其中UV :紫外吸收光谱；cond:电导率。 培养物保藏 本专利技术中杂交瘤细胞株2-PCT 2-D7送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC N0:C201136，地址位于中国武汉武汉大学，保存日期为2011年7月3日，保藏的培养物名称为杂交瘤细胞株2-PCT 2-D7。具体实施例方式下面结合实施例进ー步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而非限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆实验手册'(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)和现代免疫学实验技术(沈关心周汝麟主編)中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。实施例I PCT重组蛋白的制备 从GENBANK获取PCT编码基因的基础上，进行密码子偏嗜性改造，化学合成编码基因片段，克隆入原核表达载体经DNA测序鉴定后诱导蛋白表达，经性质鉴定后，大量纯化制备PCT重组蛋白，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为后续实验中建立PCT定量检测时的校准品，具体的 一 PCT重组蛋白基因克隆 从GENBANK获得人PCT蛋白的基因序列(登录号为NM_004102)，将其递交于Graphicalcodon usage analyzer (http://guca. schoedl. del),分析其密码子偏性情况；具体的，将人PCT基因密码子在大肠杆菌中使用率〈10%的同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子，使其更加各易在大肠杆囷中表达，优化后的核昔Ife序列为如SEQ ID N0:1所不 gcaccattca ggtctgccct ggagagcagc ccagcagacc cggccacgct cagtgaggacgaagcgcgcc 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.降钙素原B细胞表位肽段，其特征在于降钙素原B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。2.含有权利要求I所述的降钙素原B细胞表位肽段的衍生物，其特征在于所述的降钙素原B细胞表位肽段的衍生物为所述降钙素原B细胞表位肽段偶联有载体蛋白BSA或KLH。3.根据权利要求2所述的的降钙素原B细胞表位肽段的衍生物，其特征在于所述的降钙素原B细胞表位肽段在N末端引入半胱氨酸。4.权利要求1-3任一项所述的降钙素原B细胞表位肽段制备的单克隆抗体杂交瘤细胞。5.根据权利要求4所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，单克隆抗体杂交瘤细胞的生物保藏号为CCTCC NO :C201136。6.权利要求4所述的单克隆抗体杂交瘤细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄洪涛，陈安，易维京，石延宾，姚静，魏勇，张宪，胡伟，
申请(专利权)人：重庆业为基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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