α-螺旋细胞穿透肽多聚体、其产生方法及其用途技术

本发明专利技术涉及α‑螺旋细胞穿透肽多聚体，其制备方法及其用途，且具体地，涉及包含多个两向肽的肽多聚体，用于制备所述肽多聚体的方法，包含所述肽多聚体作为有效成分的用于预防或治疗HIV的组合物和包含所述肽多聚体和生物活性物质的用于将所述活性物质递送入细胞的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及α?螺旋细胞穿透肽多聚体，其制备方法及其用途，且具体地，涉及包含多个两向肽的肽多聚体，用于制备所述肽多聚体的方法，包含所述肽多聚体作为有效成分的用于预防或治疗HIV的组合物和包含所述肽多聚体和生物活性物质的用于将所述活性物质递送入细胞的组合物。【专利说明】α-螺旋细胞穿透肽多聚体、其产生方法及其用途
本专利技术涉及Ct-螺旋细胞穿透肽多聚体，其制备方法及其用途，且更具体地，涉及包 含多个两性肽的肽多聚体，用于制备所述肽多聚体的方法、包含所述肽多聚体作为活性成 分用于预防或治疗HIV的组合物和包含所述肽多聚体和生物活性物质用于细胞内递送所述 生物活性物质的组合物。
技术介绍
抗微生物肽(AMP)是从宿主的原发免疫反应产生以保护宿主免于外部入侵的病原 体的天然肽。其主要损伤入侵病原体的细胞膜由此控制入侵的病原体。然而，一些证据最近 表明此类抗微生物肽可通过抗微生物肽损伤细胞膜的机制之外的机制控制入侵的病原体。 也就是说，这些抗微生物肽可通过结合于病原体中它们的靶标来控制细菌以阻断病原体的 功能。一般地，抗微生物肽携带与DNA或DNA的负电荷结合的正电荷，表明病原体的DNA或RNA 具有作为靶标的潜力。已显示其中抗微生物肽穿透线粒体(其为病原体中的细胞器)以诱导 细胞死亡由此控制病原体的机制也是可能的。这是因为线粒体的表面带有负离子。 如上文表明，抗微生物肽不通过破坏病原体的膜杀伤病原体，而可通过与细胞中 的其他靶标结合来杀伤病原体。这也可通过如下事实来证明：具有穿透细胞的能力的细胞 穿透肽(CPP)区别于能够杀伤病原体的抗微生物肽。天然存在的细胞穿透肽主要在病毒中 发现。由于其应使用宿主细胞的全部功能用于病毒生存，因此这些肽为具有细胞穿透能力 而非细胞杀伤能力的肽。其典型的实例包括TAT肽、Rev肽等，其帮助病毒穿透细胞而不杀伤 宿主。源自触角蛋白（Antennapedia protein)的穿透肽是包含16个氨基酸且具有优异的细 胞穿透能力的典型细胞穿透肽（韩国专利No. 1095841)。与抗微生物肽相似，所述穿透肽具 有的特性为其富集带正电的精氨酸/赖氨酸(图1)。 细胞穿透肽氨基酸组成最独特的特性在于其富集了碱性氨基酸如精氨酸和赖氨 酸。由于包含由酰胺键连接的7或9个连续精氨酸残基的肽也用作细胞穿透肽，这些正电荷 对于带负电荷的细胞表面的识别是必需的。此外，出于尽管携带相同的正电荷，但精氨酸残 基比赖氨酸残基更丰富的事实，可以看出胍基相比简单的氨基是更容易处理负电荷的官能 团。 这样的细胞穿透肽应具有低于抗微生物肽的理论上可忽略的细胞毒性。由于这种 细胞穿透肽的低细胞毒性，研究了可将多种物质(其需要细胞内递送)与细胞穿透肽连接以 将这些物质引入细胞的方法。寡核苷酸如DNA或RNAi或能够导致生物改变或细胞毒性的化 合物(抗癌药)或特异性蛋白也可用作与细胞穿透肽连接并导入细胞的负载(图2)。 细胞穿透肽穿透细胞的机制主要分为两种方法，其中之一是涉及需要热量的胞吞 作用和直接穿透的方法。已知所述机制取决于每种细胞穿透肽的特征而变化或使用两种方 法的组合使细胞穿透肽进入细胞。 可出现的是具有细胞穿透能力同时不具有细胞毒性的细胞穿透肽不能够获得，因 为细胞穿透能力和无细胞毒性是矛盾的条件。由于此事实，多种细胞穿透肽还具有抗微生 物肽的特征。尽管细胞穿透肽是具有最大化的进入细胞的能力而不损伤细胞的肽，但细胞 膜可由于这些细胞穿透肽破裂，且带正电的细胞穿透肽可与带负电的细胞内物质如DNA或 RNA相遇，由此引起细胞毒性。 细胞穿透肽的形态学特性与抗微生物肽的那些相似。为穿透细胞膜，细胞穿透肽 应具有带正电荷的亲水性基团以识别带负电的细胞膜，且还应能够在膜条件中形成α-螺旋 形状同时识别存在于细胞膜中的疏水性分子。由于这些原因，细胞穿透肽和抗微生物肽应 具有两性(疏水性和亲水性)特征。因此，许多细胞穿透肽是α_螺旋肽，其典型实例为α-螺旋 细胞穿透肽如穿膜肽(penetratin)和HIV Tat。然而，即使当这些肽在最低可能浓度(微摩 尔级）使用时也可显示合意的细胞穿透效果，且因此需要开发即使以纳摩尔浓度使用时也 显示合意的细胞穿透能力的肽。 在此背景下，本专利技术人已发现，当包含亲水性和疏水性氨基酸的两性肽在一个或 多个特定的氨基酸位置含有接头时，肽的细胞穿透能力可显著增加，由此完成本专利技术。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的是提供可有效递送入细胞同时在细胞中显示减少的细胞毒性的包 含α-螺旋细胞穿透两性肽的肽多聚体、其制备方法和其用于预防或治疗HIV及细胞内递送 生物活性物质的用途。技术方案 为实现上述目的，本专利技术提供包含多个同质或异质α-螺旋两性肽的肽多聚体。 本专利技术还提供用于制备肽多聚体的方法，其包括下列步骤： 构建包含亲水性和疏水性氨基酸的α-螺旋肽； 选择多种同质或异质的α-螺旋肽;和在选自下组的一个或多个氨基酸位置连接多个所选的α-螺旋肽:i、i+3、i+4、i+7、 1+8、1+10和1+11(其中1是整数）。 本专利技术还提供用于预防或治疗HIV的组合物，其包含上述α-螺旋肽多聚体作为活 性成分。 本专利技术还提供用于细胞内递送生物活性物质的组合物，其包含权利要求1-I8任一 项的肽多聚体及所述生物活性物质。 附图简述 图1是包含多个精氨酸或赖氨酸残基的已知细胞穿透肽的列表。图2是显示将细胞穿透肽递送入细胞的机制的示意图。图3显示根据本专利技术实施方案的两性α-螺旋肽单体或二聚体。图4显示根据本专利技术实施方案的肽的细胞穿透能力的分析结果。每个误差条代表 标准偏差(η = 3)，且***和n.s.分别指示ρ〈0.001和与对照无显著差异。图4a显示与HeLa细胞温育12小时后LK-I(A)、LK-2( )、LK-3(·)、LK-4(.)和R9 (▼)在不同肽浓度的FACS结果。 图4b显示用FITC-标记的LK-3(10nM)处理的HeLa细胞的CLSM(共聚焦激光扫描显 微术)图像，其中将核用Hoechst 33442(蓝色)染色；图4c显示在IOnM的胞吞作用抑制条件下根据本专利技术的肽的相对细胞穿透能力； 图4d显示在500nM的胞吞作用抑制条件下根据本专利技术的肽的相对细胞穿透能力-对照（白色）、渥曼青霉素(wortmannin)(灰色）、阿米洛利(amiloride)(深灰色）和4°C (黑 色)； 图5显示使用根据本专利技术实施方案的肽测量递送入细胞的RNAi量的结果。 图6显示指示根据本专利技术实施方案的肽的细胞内递送机制的共聚焦显微术照片 (图6中的Ac意为乙酰基）。 图6a显示500nM FITC(异硫氰酸荧光素)-标记的单体肽(37°C，24小时）（左侧）和 用50yg/mL渥曼青霉素处理的500nM FITC-标记的单体肽(37°C，24小时）（右侧）； 图6b显示500nM Ac-FITC二聚体(37°C，24小时）（左侧）和使用50yg/mL渥曼青霉素 处理的500nM Ao-FITC二聚体(37°C，24小时）（右侧）； 图6c显示用15yg/mL阿米洛利处理的500nM FITC-标记的单体肽（37°C，24小时） (左侧)和500nM FITC单体肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肽多聚体，其包含多个同质或异质的α‑螺旋两性肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞载勋，李衍，玄纯实，蒋尚穆，
申请(专利权)人：首尔大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR