本发明专利技术属于生物医学领域，涉及一种人源性细胞膜穿透肽hPP5及其用途。本发明专利技术所提供的细胞膜穿透肽hPP5具有穿透细胞膜的功能，可携带蛋白质等大分子跨膜进入多种细胞内；且由于该肽段来源于人类蛋白，引起人体免疫反应的可能性小，潜在的不安全因素相对少，因此hPP5是一种极具开发前景的可用于蛋白、多肽等生物活性分子的跨膜运输载体，可用作细胞内药物运输载体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种细胞膜穿透肽及其用途。
技术介绍
随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学的兴起，人们发现越来越多的生物分子 比如蛋白质、多肽、核酸等均有可能成为治疗药物。但是与传统药物不同的是，这些治疗分 子在体内稳定性低，需要在胞内发挥功能的分子难以进入细胞，因而会限制其作为药物的 推广应用。故开发能有效携带这些治疗性生物大分子进入靶细胞，且经济、安全的载体系统 是亟需解决的问题。 近年来，非病毒药物运输载体以其安全性、低毒性、低免疫反应等优点被寄予厚 望。迄今比较常用的生物大分子细胞内导入方式有电穿孔、脂质体转染和有机高分子纳米 颗粒等。但可能存在着安全隐患如对细胞的毒性作用、胞内释放困难、难于组装及操作、难 于应用到个体等这样或那样的缺点。因此寻找新型的、理想的非病毒药物输送系统引起了 学者们的广泛兴趣（图1)。 在过去的20多年间，将核酸、多肽、蛋白等具有治疗作用的生物活性大分子跨膜 转运至细胞内技术的基础研究取得了突破性进展。国内外学者在对一些病毒感染特性的研 究中相继发现了一类蛋白结构域，如：HIV-lTat(48~60)、VP22 (267~300)以及果蝇蛋白 ANTP(43~58)等具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等生物活性大分子直接跨过细 胞膜进入胞浆和核内的功能，这一类富含阳离子、具有穿膜功能的短肽被称之为细胞膜穿 透肽（cell-penetratingpeptides，CPP)、穿膜肽或蛋白车专导域（proteintransduction domains，PTDs)。1988年Green和Frankel等首次发现TAT--人免疫缺陷病毒（HIV) 的转录调节蛋白可以穿透细胞膜/核膜进入细胞浆/细胞核，随后的研究发现，该蛋白 第48-60位氨基酸残基（YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全发挥其穿膜功能。以后又相 继发现了多个源自病毒或其它生物的CPP，如I型单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus type1，HSV_1)蛋白的VP22、果绳同源触角蛋白（drosophilahemeoproteinantennapedia transcriptionprotein,ANTP)、乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV)的前S抗原等。 依据其来源不同可将已经发现的CPP大致分为两类：一类为来源于病毒的短肽，如上面提 及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原等；另一类为根据天然CPP的特点人工合成的短肽，如多聚 精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各种基于不同信号序列合成的肽段等。CPP能在 体外或体内作为载药多肽，介导一系列生物活性分子如DNA、siRNA、多肽、蛋白质甚至纳米 颗粒等进入细胞，发挥各自的生物学效应。这些CPP因其本身具有低毒、副作用小、不干扰 所携带大分子生物活性等特点，被广泛用于体外或/和体内向细胞内运送生物活性分子， 尤其是在抗肿瘤治疗的应用研究方面更是引人注目。CPP研究在基础生物学和应用研究上 都具有极大意义，作为一种有效的胞内运载工具，有着广泛的应用前景（图2)。 然而来源于病毒或其他种属生物蛋白结构域的CPP，在临床应用上可能仍然存在 一定的安全隐患，比如可能的细胞毒性和免疫原性问题。人们对TAT作为CPP进行了大量 研究，腹腔注射Tat-0 -半乳糖苷酶，能进入小鼠各种脏器组织，甚至可以透过血脑屏障进 入脑组织。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全忧患，一直未能用于临床研究。另 有报道称，应用TAT携带药物的上呼吸道喷雾引发了严重的肺部病理反应。可见，针对不同 治疗需要，开发更为安全的、新型细胞膜穿透肽一一人源性细胞膜穿透肽（hCPP)是非常必 要的。 2002年，Beck-SickingerAG小组开创性地发现了第一个人源性细胞膜穿透 肽一一来源于人降血钙素（hCT)的第9-32的残基。随后相继报道的人源性细胞膜穿透肽还 有来自于hCLOCK蛋白（一种与生物节律调节有关的蛋白，2004年）、Hph-l( -种人源转录 因子，2006年）、Bag-l蛋白（一种可与Bcl-2相互作用的激活糖皮质激素受体的蛋白，2006 年）、pl4ARF蛋白（一种人抑癌基因蛋白，2008年）、人乳铁蛋白（2009年）、人Cytc77-101 及Cytc86-101 (2010年）和TCTP蛋白（来源于人翻译控制肿瘤蛋白氨基末端10个氨基酸 残基，2011年）的CPP等。与其它物种蛋白来源的CPP相比，人源性CPP引起人体的免疫反 应的可能性小，潜在的不安全因素相对少，作为人类疾病治疗的药物载体，具有绝对优势， 有着更广阔的开发、应用前景。FutakiS等发现细胞膜穿透肽的穿膜能力与多肽序列中精氨酸残基的数量和位 置有很大的相关性。我们在从事细胞膜穿透肽研究中，通过对蛋白数据库中一级结构的检 索、分析发现人源性的组蛋白去甲基化酶PHD锌指蛋白13(PHDfingerprotein13)的一 段长为20个氨基酸的短肽的一级结构富含属于碱性氨基酸的精氨酸和赖氨酸，分布着很 强的正电荷，这与大多数已知CPP的结构特点很相似，继而分析其二级结构，发现它可形成 经典的a-螺旋构象。推测这段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性细胞膜穿透 肽。我们继而合成了这段短肽并命名为hPP5,观察了其对培养细胞的穿膜效率，细胞毒性及 穿膜机制，同时还观察、评估了其向细胞内递送绿色荧光蛋白（GFP)的效果，为hPP5作为一 种新型人源性药物运输载体的开发提供了科学依据。
技术实现思路
在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验 室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供 相关术语的定义和解释。 如本文中所使用的，术语"生物分子"是指，存在于生物体中的分子的总称，包括但 不限于，核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和小分子化合物以及其任意的复合物。 术语"寡肽"通常是指2-10个氨基酸组成的肽。术语"多肽"通常是指11个以上 的氨基酸组成的肽。术语"蛋白质"通常是指含有51个以上的氨基酸残基的多肽链。 本专利技术的目的是提供一种新的细胞膜穿透肽hPP5,本专利技术提供的细胞膜穿透肽hPP5是源于人类组蛋白去甲基化酶PHD锌指蛋白13的一段多肽序列，其具有细胞膜穿透能 力，所述多肽序列的长度在20个氨基酸以内，所述的细胞优选真核细胞，更优选动物细胞， 最优选哺乳动物细胞，例如肿瘤细胞。 本专利技术所述细胞膜穿透肽hPP5的多肽序列包含SEQIDN0 :1所示的序列，即Phe-Leu-Leu-Asp-Arg-Lys-Lys-Thr-Asp-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Arg -Arg(SEQIDNO:1)(苯丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨 酸-苏氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨 酸-精氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸），优选地，所述细胞膜穿透肽h本文档来自技高网...
【技术保护点】
细胞膜穿透肽hPP5，其特征在于该细胞膜穿透肽hPP5是源于人类组蛋白去甲基化酶PHD锌指蛋白 13的一段多肽序列，其具有细胞膜穿透能力，所述多肽序列的长度在二十个氨基酸以内；优选地，所述细胞膜穿透肽hPP5包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；优选地，所述细胞膜穿透肽hPP5的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；优选地，所述的细胞膜穿透肽hPP5为合成的或重组的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柳长柏，王琥，邹黎黎，马节兰，杨英桂，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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