一种烟草谷胱甘肽转移酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟草谷胱甘肽转移酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所述。烟草谷胱甘肽转移酶基因NtGSTU17在去毒代谢中的作用，及其在烟用农药安全剂筛选中的应用，属于生物技术领域。谷胱甘肽转移酶（GST）是生物体去毒代谢过程中普遍存在的关键酶，烟草NtGSTU17蛋白具有较高的去毒活性，其编码基因在烟草中组成型表达，并在某些农药处理后显著上调表达，表明该基因在烟用农药脱毒及筛选方面具有应用价值和经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及烟草去毒代谢途径关键基因烟草谷胱甘肽转移酶基因NtGSTU17在烟 用农药脱毒及农药安全剂筛选上的应用。
技术介绍
谷胱甘肽转移酶（GlutathioneTransferase，GSTs)是自然界多样性最为丰富的 蛋白酶之一。GSTs具有多种催化活性：可以将还原性谷胱甘肽（GSH)共价偶联到含有亲电 子碳、氮、硫原子的非极性化合物上，从而使GSTs做为中心元件参与到药物、农药及其它异 源物质的去毒代谢过程；GSTs还可以催化还原一些氧化胁迫的代谢产物，如过氧化物等， 从而使得GSTs在防御病菌侵染和非生物胁迫中发挥重要的作用。植物体内的谷胱甘肽转 移酶研究始于Fear在1970年对玉米抗除草剂阿特拉津GSTs的研究，此后在高梁、甘蔗、 大豆、豌豆、烟草等作物体内也相继发现了GSTs活性。现代的研究已表明GSTs是植物体 内普遍存在的一个同工酶家族，分为phi(GSTF)、tau(GSTU)、theta(GSTT)、lambda(GSTL)、 DHAR、zeta(GSTZ)、DHCQD共7大类，其中phi类和tau类是植物所特有的GSTs蛋白。Tau 类GSTs是植物GSTs家族中多样性最丰富的一类。用除草剂或过氧化氢处理水稻，水稻 GSTU17(0sGSTU17)在不同组织中的转录水平明显不同，说明该基因在响应非生物胁迫信号 时具有不同的调控机制。大豆GSTU4(GmGSTU4)转基因烟草表现出对除草剂甲草胺和消草 醚的增强的耐受性，即GmGSTU4对这两种除草剂较高的脱毒效率。 农药安全剂是指可以显著提高作物去毒途径的酶的表达，如谷胱甘肽转移酶，从 而降低农药在作物中的残留毒性达到相对安全的一类农用化学品。烟草是我国的重要经济 作物，在国民经济中占重要的地位，但其在生产实践中生物病害、杂草等因素严重影响着烟 草的生产，给烟农造成巨大经济损失。因此农药的施用在烟草生长阶段非常普遍，开发、筛 选对烟草低毒尤其是在烟草中具有较高脱毒效率的农药安全剂对于降低农药残留、提高烟 草品质具有重要意义，并且对其它作物具有借鉴、参考乃至使用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用一种具有高去毒活性的谷胱甘肽转移酶来筛选烟用农药 安全剂，为烟草农业提供参考。 本专利技术的技术方案是： -种烟草谷胱甘肽转移酶蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo:1所述。 -种烟草谷胱甘肽转移酶基因，编码权利要求1所述的烟草谷胱甘肽转移酶蛋 白。 -种烟草谷胱甘肽转移酶基因，其碱基序列如SEQIDN0 :2所示。 所述烟草谷胱甘肽转移酶基因的特异性核酸片段是序列表中SEQIDN0 :2的第 16-238和274-630位核苷酸序列。 所述的烟草谷胱甘肽转移酶基因在烟用农药筛选中的应用。 所述的烟草谷胱甘肽转移酶基因在农药脱毒中的应用。 本专利技术的有益效果是：本专利技术对栽培种烟草（NicotianatobacumL.)谷胱甘肽转 移酶基因NtGSTU17进行了克隆，利用体外表达纯化技术对该基因表达产物进行了纯化，并 对其活性进行了分析，利用荧光实时定量PCR(RT-PCR)技术对该基因在不同农药处理下的 表达情况进行分析，为在烟草中具有高脱毒效率的农药筛选提供依据。【附图说明】 图1为烟草GSTU17蛋白对CDNB的偶联活性； 图2为不同农药处理下NtGSTU17的相对表达量。【具体实施方式】 烟草谷胱甘肽转移酶基因NtGSTU17编码蛋白质具有较高的⑶NB偶联活性，一般 认为高CDNB偶联活性意味着高的抗除草剂活性和去毒活性。在利用不同农药处理烟草幼 苗时，烟草谷胱甘肽转移酶基因NtGSTU17表现出不同的表达特性，说明烟草对不同农药的 抗性和脱毒效率不同。鉴于该基因表达蛋白所具有的去毒活性，其在去毒代谢反应中可能 发挥重要作用，在筛选低毒、易清除农药及农药安全剂中具有一定的应用价值和应用前景， 有必要通过专利加以保护。 本专利技术提供的基因来源于烟草（Nicotianatabacum)，命名为NtGSTU17,编码一种 烟草谷胱甘肽转移酶蛋白，是如下（i)或（ii)的蛋白质： (i)序列表中的SEQIDNo:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (ii)序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且与植物谷胱甘肽转移酶相关的由序列1衍生的蛋白质。 序列表中的SEQIDNo. 1序列由221个氨基酸残基组成。所述取代、缺少或添加 的一至十个氨基酸残基可以是上述氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对 氨基酸残基进行取代、缺少或添加，以及对相对功能的检测可以通过本领域的常规技术来 实现。 本专利技术的烟草谷胱甘肽转移酶基因NtGSTU17可以是CDNA序列，也可以是基因组 DNA序列，或者是与这些序列具有90 %以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如 序列表中SEQIDNo. 2所示的cDNA序列。 利用同源克隆的方法，设计引物克隆了NtGSTU17的0RF全长序列（SEQIDNo. 2)， 其编码的蛋白序列如序列表中的SEQIDNo:1所不，序列结果分析表明，该蛋白含有GST超 家族tau类蛋白的保守功能域。表达谱分析表明该基因在烟草各个组织中组成型表达。通 过重组表达纯化，体外活性分析表明，该基因表达蛋白对GST家族通用底物CDNB具有较高 的偶联活性（图1)。 基于上述研究，本专利技术利用real-timePCR(RT-PCR)技术，设计对NtGSTU17高特 异性的RT-PCR引物，发现该基因在低温、干旱、病毒侵染等胁迫条件下上调表达，对不同农 药施用则表现出选择性上调表达。可见，NtGSTU17在氧化应激、去毒代谢中发挥重要功能， 其对农药的选择性反映出部分农药可以通过去毒途径进行脱毒，说明利用NtGSTU17筛选 出可以进入烟草去毒代谢途径的烟用农药，即在筛选低毒、低残留、高降解的烟用农药安全 剂方面具有潜在的应用价值和经济价值。 表1.NtGSTU17的特异RT-PCR引物信息 表 2.NtGSTU17 的RT-PCR操作程序 首先，根据NtGSTU17基因的核苷酸片段（序列表SEQIDNo:2)，以200bp左右为 扩增长度设计多条RT-PCR引物，经过验证，选取特异性最好的一对引物作为RT-PCR扩增引 物，引物信息如表1所示。 具体筛选步骤如下： (1)烟草种子播种于育苗钵中育苗，生长5 - 6周后，选取长势一致的待用； (2)将代森锰锌（低毒杀菌剂）、甲基托布津（广谱性内吸低毒杀菌剂）、百草枯 (除草剂）按照使用说明的用量和方式施用到烟苗上，两小时后取样，每个处理最少取3株， 地上部取第三第四位叶混合，地下部取整个根部，清水洗净、擦干，液氮冷冻备用； (3)将液氮冷冻样品用基因研磨仪粉碎，提取RNA，反转录成cDNA，置于-20°C保存 备用。 (4)按照罗氏荧光定量试剂盒的操作说明进行RT-PCR，选用栽培种烟草核糖体蛋 白L25基因作为内参基因，PCR程序如表2所示。 (5)计算NtGSTU17的相对表达量，结果如图2所示，代森锰锌处理后，NtGSTU17基 因的表达量显著上调，说明代森锰锌在烟草植株中可能通过烟草的去毒代谢途径被降解，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草谷胱甘肽转移酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所述。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周会娜，翟妞，陈千思，刘萍萍，陈霞，毛李鸿，郑庆霞，金立锋，林福呈，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41