一种成肌细胞膜片及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种成肌细胞膜片及其制备方法，所述的成肌细胞膜片为通过脂肪干细胞定向诱导而得到的。本发明专利技术提供的成肌细胞膜片，在具备良好机械性能同时，能够高表达肌细胞标志蛋白，可用于肌肉损伤及修复重建。本发明专利技术还提供了上述成肌细胞膜片的制备方法。上述成肌细胞膜片及其制备方法十分具有实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程与再生医学领域，尤其涉及一种成肌细胞膜片及其制备方法。
技术介绍
肌细胞是一种终末分化细胞，再生能力差，肌肉损伤后主要以瘢痕修复为主，继而影响其运动及收缩功能。临床上多种疾病病因与肌肉损伤或功能异常密切相关，如压力性尿失禁、肌无力、杜氏肌营养不良等，但目前治疗手段有限且疗效欠佳。正常肌细胞由肌卫星细胞分化而成，后者是位于基膜下的一类静息期肌源性干细胞，其数量随年龄增长而不断降低，至成年时仅剩下不足7％，因此难以满足广泛而严重的肌肉再生需求。利用干细胞移植修复是目前组织工程研究的热点，通常将干细胞通过体外诱导技术促其定向分化，继而细胞悬液注射组织损伤处进行修复，并已取得一定疗效。但是这种利用细胞悬液原位注射有一些缺陷难以克服：首先，干细胞属于贴壁生长，细胞直接注射之前须通过酶消化使其分散形成细胞悬液，这样不可避免影响细胞活性和丢失细胞；其次，几乎所有文献均提及注射的细胞聚集在注射点周围，仅有少量细胞沿正常肌纤维组织深入生长，因此如何使细胞在植入受损周围并形成更为均匀的分布，以整体区域修复，而非若干点修复，将是影响最终临床疗效的关键。细胞膜片技术是通过刺激细胞外基质大量分泌并连接细胞形成一种细胞密度高、细胞分布均匀、质地均一的膜片状组织的技术。已有研究证实，细胞膜片中细胞无须胰酶消化处理，直接移植修复后，细胞凋亡率低，细胞活性保持长达12个月。脂肪干细胞是组织工程应用最常见干细胞类型之一，具有细胞活性高、脂肪组织中含量丰富、取材简便、可重复切取、机体损伤小等优势。脂肪干细胞具有多向分化潜能，分化能力强，多项研究证实添加5-氮杂胞苷及马血清可促
进其成肌分化。干细胞诱导技术和细胞膜片技术均为近年来发展起来的组织工程关键技术之一，然而单独应用存在一定局限性，目前国内外均未见将脂肪干细胞诱导成肌技术结合细胞膜片技术应用于肌肉修复重建研究中。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种成肌细胞膜片及其制备方法。本专利技术第一方面提供了一种成肌细胞膜片，所述的成肌细胞膜片为通过脂肪干细胞定向诱导而得到的。较佳地，所述的成肌细胞膜片由细胞膜片技术与干细胞成肌诱导技术结合而构建的肌分化膜片状组织组成。本专利技术第二方面提供了上述的成肌细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将脂肪干细胞高密度地接种于细胞培养皿中；步骤二：在所述的细胞培养皿中加入梯度浓度维生素进行刺激，并加入5-氮杂胞苷和马血清诱导，得到所述的成肌细胞膜片。较佳地，所述的高密度为5×104个/cm2。较佳地，所述的步骤二中加入梯度浓度维生素进行刺激为以100μg/ml维生素C强刺激3天，更换50μg/ml维生素C温和刺激18天。较佳地，所述的步骤二中加入5-氮杂胞苷和马血清诱导，所述的5-氮杂胞苷浓度为10μmol/L，所述的马血清含量为5％，诱导时间为3周。本专利技术提供的成肌细胞膜片，在具备良好机械性能同时，能够高表达肌细胞标志蛋白，可用于肌肉损伤及修复重建。维生素C在细胞外基质形成过程中起着关键作用，可显著促进细胞胶原合成，形成细胞-基质连接以及细胞间连接三维立体结构，在既往报道的细胞膜片构建中广泛使用。5-氮杂胞苷是一种甲基转移酶抑制剂，与控制向肌源性分化的特异启动子基因上阻遏蛋白结合，诱导DNA去甲基化，激活肌源性调节因子，启动干细胞向成肌分化。马血清中含有促干细胞成肌分化的调节因子，与5-氮杂胞苷联合使用促加强成肌分化能力。因此，我们在本专利技术中利用维生素C促进细胞膜片形成的同时，联合5-氮杂胞苷/马血清促进脂肪干细胞成肌分化，构建一种成肌诱导细胞膜片。该膜片表面平整，质
地均一，细胞外基质含量丰富，厚度大，具备较好抗牵拉特性，不易破裂，具有临床应用的可操作性，成肌确切，能自体移植。其厚度和机械性能具备可操作性，成肌确切，有望应用于肌肉损伤修复。附图说明图1为成肌细胞膜片HE染色观察图；图2A和2B为成肌细胞膜片扫描电镜观察图；图3为成肌细胞膜片中α-SMA和Desmin基因水平表达图；图4A和图4B为成肌细胞膜片中α-SMA和Desmin蛋白水平表达图；图5为免疫组化分析成肌细胞膜片中α-SMA和Desmin蛋白分布图。具体实施方式下面参照附图，结合具体的实施例对本专利技术作进一步地说明，以更好地理解本专利技术。1、脂肪干细胞原代培养比格犬，6-8个月，戊巴比妥全身麻醉后无菌切取腹股沟处10g脂肪组织，剔除肉眼可见筋膜及血管，0.25％氯霉素浸泡30分钟，PBS漂洗3遍，眼科剪尽量剪碎成肉沫状，加入0.1％Ⅰ型胶原酶在37℃中消化1h，100目滤网过滤，300g离心5min，加入干细胞培养基重悬后接种于100mm细胞培养皿中继续培养，每2-3天更换培养基。脂肪干细胞培养基组成：450ml低糖DMEM培养基+50ml胎牛血清+100U/ml青霉素+100mg/ml硫酸链霉素，0.22μm滤网过滤除菌。2、脂肪干细胞纯度鉴定将原代培养脂肪干细胞传代至P2，流式细胞仪鉴定其干细胞纯度，选取CD45、CD90、CD105作为表面抗原标志，0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA消化后4％多聚甲醛固定15分钟，PBS清洗2遍，300g离心5min后加入250μl PBS重悬，分别加入2μl CD45-FITC抗犬抗体、1μl CD90-PE抗犬抗体、2μl CD105-FITC抗犬抗体，在4℃条件下避光孵育30分钟，PBS清洗2遍，上机检测。3，脂肪干细胞成肌诱导膜片制备将P2代脂肪干细胞以5×104个/cm2接种于60mm细胞培养皿，待细胞融合至90％以上时，更换干细胞成肌诱导培养基A继续培养，3天后更换干细胞成肌诱导培养基B连续培养18天，每2天更换细胞培养液，培养3周即可成制备一种基于脂肪干细胞定向诱导的成肌细胞膜片，可直接用镊子轻轻撕下。干细胞成肌诱导培养基A成分：425mL低糖DMEM培养基、50mL胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL硫酸链霉素、10μM 10μmol/L的5-氮杂胞苷、25mL含量为5％的马血清、100μg/ml的维生素C、3.7g/L NaHCO3，上述培养基PH值为7.2。干细胞成肌诱导培养基B成分：425mL低糖DMEM培养基、50mL胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL硫酸链霉素、10μM 10μmol/L 5-氮杂胞苷、25mL含量为5％马血清、50μg/mL维生素C、3.7g/L NaHCO3，上述培养基PH值为7.4如图1所示，诱导培养3周后收获膜片状物，表面平滑，灰白样外观，质地均匀，具有较好机械性能，能用镊子提起；HE染色显示，脂肪干细胞成肌诱导膜片由7-8层细胞构成，厚度约100μm，细胞之间紧密连接形成致密片状整体。4、脂肪干细胞成肌诱导膜片鉴定1)扫描电镜观察细胞膜片成肌诱导3周至细胞膜片形成后，取小于1cm2细胞膜片样品，生理盐水清洗3遍，1.25％戊二醛4℃预固定2h，0.1M磷酸缓冲液清洗3次，每次15分钟，1％饿酸4℃固定2h，酒精梯度脱水，临界点干燥仪中干燥约2h，双面胶将干燥样品粘贴于样品台上，喷金3分钟，扫描电镜观察。如图2A和2B所示，低倍镜下(×800)观察成肌诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种成肌细胞膜片，其特征在于，所述的成肌细胞膜片为通过脂肪干细胞定向诱导而得到的。

【技术特征摘要】
1.一种成肌细胞膜片，其特征在于，所述的成肌细胞膜片为通过脂肪干细胞定向诱导而得到的。2.根据权利要求1所述的成肌细胞膜片，其特征在于，所述的成肌细胞膜片是由细胞膜片技术与干细胞成肌诱导技术结合而构建的一种肌分化膜片状组织。3.一种根据权利要去1所述的成肌细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将脂肪干细胞高密度地接种于细胞培养皿中；步骤二：在所述的细胞培养皿中加入梯度浓度维生素进行刺激，并加入5-氮杂胞苷和马血清诱导，得到所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅强，周术奎，
申请(专利权)人：上海市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31