一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，在采集软骨细胞的过程中具有打磨软骨表面的步骤，最大限度地排除了后续滑膜细胞的污染；采取过程开创性的采用了活检针切取内部软骨组织，使得采样直接针对目的细胞，不但直接有效，同时巧妙地避免了潜在的细菌和真菌污染；同时，本发明专利技术的原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，使用的特殊制备的复合酶消化液，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法。
技术介绍
软骨细胞位于软骨中，主要作用是合成某些胶原蛋白以及非胶原的高分子细胞外基质，包括：II型胶原蛋白、蛋白多糖、链接蛋白、IX型胶原蛋白和XI型胶原蛋白。调控软骨细胞的增殖和分化，对于协调脊椎动物的骨骼发育至关重要。软骨细胞可以产生大量的肽生长因子和细胞因子，并与之发生反应，例如：胰岛素样生长因子－1和白介素－1。在研究软骨的再生和修复、细胞因子和生长因子对软骨的作用、特定基因对关节炎的调控作用及关节炎的病理生理过程中，软骨细胞的培养是非常重要的体外模型。目前，国内外已经有大量的研究者进行了小鼠/大鼠软骨细胞的培养和药理学特性方面的研究，既往的研究多采用0.25％胰酶37度水浴消化1个小时，再用II型胶原酶37度消化5个小时左右。其缺点在于，绝大多数的酶在37度的条件下都会发生剧烈的消化作用，因此，一方面可以加快消化的速度，但是另一方面，又会对细胞造成极大的伤害，尤其是胰酶更是如此。从而导致的结果是，消化时间不好掌握，往往消化时间过长，细胞碎片居多，杂细胞比较多而软骨细胞比较少，并且获得的细胞活力差，随着培养时间的延长及传代，有活力的软骨细胞越来越少，细胞逐渐死亡。同时，软骨细胞的采集过程中，其他细胞如滑膜细胞的污染非常常见，加之上述的酶消化过程，很容易造成软骨细胞数量不占优势，而其他耐受性较高的杂细胞反而分离得到较多。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的一种高纯度、高活率、高活性同时低污染的原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法。为了实现上述技术目的，本专利技术所采取的技术措施为：一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：软骨组织的预处理清理离体的半月板，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗，然后打磨半月板表面，再次使用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；步骤2：取软骨细胞使用小型活检针刺入步骤1处理后的半月板，切取半月板内部软骨细胞；步骤3：酶消化将步骤2获得的软骨细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养软骨细胞将步骤3消化完毕的软骨细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到软骨细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，上述步骤2中使用的小型活检针为小型半自动或全自动活检针。优选地，上述步骤3中复合酶消化液中各个酶的初始浓度均为1mg/ml。优选地，上述步骤3中酶消化过程为使用4℃复合酶消化液消化4-20h；或者使用37℃预热的复合酶消化液消化10min-2h。优选地，上述步骤4的培养基还包括5ug/ml的转铁蛋白和10ug/ml的胰岛素。优选地，上述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Williams'medium E培养基或DMEM或F12培养基；更优选为DMEM培养基。优选地，上述双抗为青链霉素。另一方面，本专利技术还提供一种根据上述的原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法所培养的小鼠或大鼠软骨细胞。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：首先，本专利技术在采集软骨细胞的过程中，具有打磨软骨表面的步骤，最大限度地排除了后续滑膜细胞的污染；其次，采取过程开创性的采用了活检针切取内
部软骨组织，使得采样直接针对目的细胞，不但直接有效，同时巧妙地避免了潜在的细菌和真菌污染；同时，本专利技术的原代小鼠/大鼠软骨细胞的分离培养方法，使用的特殊制备的复合酶消化液，复合酶消化液由I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶组成，并使用4℃条件过夜消化(4-20h)，相比传统单一的胶原酶预热消化(特殊情况下可用37℃消化)，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。综上所述，本专利技术的的原代小鼠/大鼠软骨细胞的分离培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的原代小鼠/大鼠软骨细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，具有较大的推广意义。附图说明图1为本专利技术的分离培养方法得到的小鼠软骨细胞显微照片(10X)；图2为本专利技术的分离培养方法得到的小鼠软骨细胞显微照片(20X)。具体实施方式本专利技术提供了一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，包括以下步骤：一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：软骨组织的预处理清理离体的半月板，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗，然后打磨半月板表面，再次使用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；步骤2：取软骨细胞使用小型活检针刺入步骤1处理后的半月板，切取半月板内部软骨细胞；步骤3：酶消化将步骤2获得的软骨细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养软骨细胞将步骤3消化完毕的软骨细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到软骨细胞，使用含10％-20％
胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。实施例1本实施采用SD大鼠，应用本专利技术的方法采集和培养软骨细胞，具体步骤如下:1.大鼠关节软骨组织的提取首先处死新生SD大鼠(冰冻10分钟或者颈椎脱臼)，酒精浸泡5分钟。剪取四肢，将取下的四肢浸泡在含2％青链霉素的PBS里，放在冰上保存。2.半月板的剥离在解剖显微镜下，用眼科剪仔细剥除四肢的皮肤和肌肉，尽量完全去除，最大限度地避免杂细胞的混入。将关节切开，暴露关节面，可以看到关节腔里的半月板，将其取出收集。3.软骨组织的预处理清理离体的半月板，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗，然后打磨半月板表面，再次使用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；充分清洗去除打磨后的软骨表面可能误带的滑膜组织。4.酶消化将处理后变白的软骨组织剪碎，加入复合酶消化液(I型胶原酶+II型胶原酶+IV型胶原酶+Dispase酶＝1:1:1:1)，4种酶的初始浓度均为1mg/ml。在4度冰箱过夜，便于酶与组织充分结合，使组织松散，细胞容易剥离。这样可以避免消化过程中，对细胞的过度消化和过度吹打，对细胞造成极大的伤害。第2天，将组织从冰箱中取出，稍微吹打几次，放入37度水浴30分钟，再次轻微吹打不超过10次。根据情况，可再次放入37度水浴30分钟，最后，轻微吹打不超过10次，过70um筛网。5.离心纯化取过筛后的细胞滤液，进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到软骨细胞，然后用0.2％台盼兰计数活细胞数。6.培养基配制由于软骨细胞的特殊性，在配制完全培养基时，需要加入细胞因子，即基础培养基为含10％胎牛血清、1％青链霉素的DM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：软骨组织的预处理清理离体的半月板，并利用含双抗和两性霉素B的D‑hanks溶液冲洗，然后打磨半月板表面，再次使用含双抗和两性霉素B的D‑hanks溶液冲洗；步骤2：取软骨细胞使用小型活检针刺入步骤1处理后的半月板，切取半月板内部软骨细胞；步骤3：酶消化将步骤2获得的软骨细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养软骨细胞将步骤3消化完毕的软骨细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到软骨细胞，使用含10％‑20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。

【技术特征摘要】
1.一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：软骨组织的预处理清理离体的半月板，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗，然后打磨半月板表面，再次使用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；步骤2：取软骨细胞使用小型活检针刺入步骤1处理后的半月板，切取半月板内部软骨细胞；步骤3：酶消化将步骤2获得的软骨细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养软骨细胞将步骤3消化完毕的软骨细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到软骨细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。2.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤2中使用的小型活检针为小型半自动或全自动活检针。3.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤3中复合酶消化液中各个酶的初始浓度均为...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓冰，杨国峰，
申请(专利权)人：王晓冰，杨国峰，
类型：发明
国别省市：上海;31