一种原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，开创性的采用了活检针采取处理后的组织，使得采样直接针对目的细胞，不但直接有效，同时巧妙地避免了表面包膜细胞以及细菌的混入，降低了细胞、细菌污染的同时，大大提高了目的细胞的纯度，分离细胞时即可接近100％。同时，本发明专利技术的原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，使用特殊制备的复合酶消化液，并使用4℃条件过夜消化(4‑20h)，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法。
技术介绍
骨骼肌细胞是机体最大的细胞之一，含多个细胞核，由多个成肌细胞融合而成。骨骼肌细胞的再生是一个非常复杂的过程。当骨骼肌细胞受损时，肌肉内沉默的成肌细胞(又叫肌卫星细胞)被激活，发生增殖、迁移和分化。研究发现，在骨骼肌细胞生长发育过程中，有多种细胞信号通路发挥重要作用，如：磷脂酰肌醇激酶3、磷酸酶、JAK2、STAT3、MAPK等。GLUT4介导了培养的骨骼肌细胞中胰岛素激活的葡萄糖转运，骨骼肌细胞的分化则与硫酸肝素蛋白多糖有关。多核细胞的融合形成多核的肌小管是骨骼肌细胞发育过程中的重要过程。控制这一过程的开启和进展，需要成肌细胞和其所处环境进行复杂地相互作用。因此，骨骼肌细胞的培养是研究细胞分化过程的一种很有用的模型，而这种模型的一般是建立在小鼠/大鼠的骨骼肌细胞的分离和培养上。但在实际操作中，小鼠/大鼠的骨骼肌细胞的分离和培养存在诸多问题。首先，国内外既往的研究多采用I型胶原酶37度消化1个小时，再用0.25％胰酶37度水浴消化30分钟。其缺点在于，绝大多数的酶在37度的条件下都会发生剧烈的消化作用，因此，一方面可以加快消化的速度，但是另一方面，又会对细胞造成极大的伤害，尤其是胰酶更是如此。从而导致的结果是，消化时间不好掌握，往往消化时间过长，细胞碎片居多，杂细胞比较多而骨骼肌细胞比较少，并且获得的细胞活力差，随着培养时间的延长及传代，有活力的骨骼肌细胞越来越少，细胞逐渐死亡。其次，骨骼肌的分离和培养过程中常常有杂细胞和细菌等污染，大大影响原代和传代培养效果。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的一种高纯度、高活率、高活性同时低污染的原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法。为了实现上述技术目的，本专利技术所采取的技术措施为：一种原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：步骤1：骨骼肌组织的预处理清理离体的骨骼肌组织，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；步骤2：取骨骼肌细胞使用活检针刺入步骤1处理后的骨骼肌组织，切取骨骼肌细胞；步骤3：酶消化将步骤2获得的骨骼肌细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养骨骼肌细胞将步骤3消化完毕的骨骼肌细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到骨骼肌细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：进一步地，上述步骤1中清理离体的骨骼肌组织的操作为使用眼科剪剥除骨骼肌组织的皮肤、脂肪、肌腱和肌膜结缔组织。进一步地，上述步骤2中使用的活检针为半自动或全自动活检针。进一步地，上述步骤3中复合酶消化液中各个酶的浓度均为1mg/ml。进一步地，上述步骤3中酶消化过程为使用4℃复合酶消化液消化4-20h；消化时间更优选为12h。进一步地，上述步骤3中酶消化过程还可以为使用37℃预热的复合酶消化液消化10min-2h。进一步地，上述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Williams′medium E培养基或DMEM/F12培养基；优选为DMEM培养基。进一步地，上述双抗为1％青链霉素。 本专利技术另一方面还提供根据上述的原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法所培养的小鼠和大鼠骨骼肌细胞。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：首先，本专利技术开创性的采用了活检针采取处理后的组织，使得采样直接针对目的细胞，不但直接有效，同时巧妙地避免了表面包膜细胞以及细菌的混入，降低了细胞、细菌污染的同时，大大提高了目的细胞的纯度，分离细胞时即可接近100％。其次，本专利技术的原代小鼠/大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，使用的为申请人特殊制备的复合酶消化液，复合酶消化液由I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶组成，并使用4℃条件过夜消化(4-20h)，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。综上所述，本专利技术的的原代小鼠/大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的原代小鼠/大鼠骨骼肌细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，具有较大的推广意义。附图说明图1为本专利技术的分离培养方法得到的小鼠骨骼肌细胞使用荧光染色(DAPI)细胞核拍摄的显微照片(10X)；图2为本专利技术的分离培养方法得到的小鼠骨骼肌细胞使用荧光染色肌球蛋白拍摄的显微照片(10X)。具体实施方式本专利技术提供了一种原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：步骤1：骨骼肌组织的预处理清理离体的骨骼肌组织，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；步骤2：取骨骼肌细胞使用活检针刺入步骤1处理后的骨骼肌组织，切取骨骼肌细胞；步骤3：酶消化将步骤2获得的骨骼肌细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养骨骼肌细胞将步骤3消化完毕的骨骼肌细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到骨骼肌细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。实施例1本实施例采用小鼠，使用本专利技术的分离培养方法分离骨骼肌细胞，具体步骤如下：1.小鼠四肢的提取首先处死新生小鼠(冰冻10分钟或者颈椎脱臼)，酒精浸泡5分钟。剪取四肢，将取下的四肢初步清理后放在冰上保存，获得离体的骨骼肌组织。2.骨骼肌组织的预处理清理离体的骨骼肌组织，在解剖显微镜下，用眼科剪仔细剥除四肢的皮肤、脂肪、肌腱和肌膜等结缔组织，尽量完全去除，以免杂细胞的污染。反复清洗去除骨髂肌表面的血液以及可能误带的结缔组织，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗。骨髂肌处理成功的标志为，肌组织呈白色，没有红色的血凝块、黄色的脂肪及白色的筋膜组织残留。3.骨髂肌细胞的提取和复合酶消化使用半自动活检针刺入处理后的骨骼肌，切取内部骨骼肌细胞(可取多次)，转入复合酶消化液4℃消化过夜。4.离心纯化消化完毕的骨骼肌细胞过70um筛网，取过筛后的细胞滤液，根据体积加入对等的PBS，400g离心5分钟，即可获得进一步纯化的小鼠骨髂肌细胞，然后用0.2％台盼兰计数活细胞数，接种培养。5.培养基配制 由于骨髂肌细胞的特殊性，在原代培养、传代和复苏的第一天，用含20％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基。其它时间，用含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基。6.二维培养将纯化的小鼠或大鼠骨髂肌细胞用上述培养基重悬，制得骨髂肌细胞重悬液，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5*106/瓶。置于37度，5％CO2的培养箱中进行培养。为了充分去除骨髂肌成纤维细胞，根据差速贴壁的原理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：骨骼肌组织的预处理清理离体的骨骼肌组织，并利用含双抗和两性霉素B的D‑hanks溶液冲洗；步骤2：取骨骼肌细胞使用活检针刺入步骤1处理后的骨骼肌组织，切取骨骼肌细胞；步骤3：酶消化将步骤2获得的骨骼肌细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养骨骼肌细胞将步骤3消化完毕的骨骼肌细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到骨骼肌细胞，使用含10％‑20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。

【技术特征摘要】
1.一种原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：骨骼肌组织的预处理清理离体的骨骼肌组织，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；步骤2：取骨骼肌细胞使用活检针刺入步骤1处理后的骨骼肌组织，切取骨骼肌细胞；步骤3：酶消化将步骤2获得的骨骼肌细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养骨骼肌细胞将步骤3消化完毕的骨骼肌细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到骨骼肌细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。2.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤1中清理离体的骨骼肌组织的操作为使用眼科剪剥除骨骼肌组织的皮肤、脂肪、肌腱和肌膜结缔组织。3.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠骨骼肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤2中使用的活检针为半自动或全自动活...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓冰，杨国峰，
申请(专利权)人：王晓冰，杨国峰，
类型：发明
国别省市：上海;31