一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，开创性地使用活检针营造了一个消化腔，不但在用活检针打开通路(即消化腔入口)时去除了脂肪组织块表面杂细胞(包膜、结缔组织等)，而且形成了一个完全在脂肪组织块内部的消化腔，使得在后续的消化过程中，酶消化液得到了最大程度的利用，同时巧妙地避免了消化过程中的污染；同时消化效果好，解决了消化不良和过度消化的问题；本发明专利技术能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的脂肪间充质干细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，具有较大的推广意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法。
技术介绍
脂肪间充质干细胞是一种典型的成体干细胞。其具有分化为成熟的脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肌腱细胞和骨骼肌细胞的潜能。这些特性及其具有的发育可塑性，引起了人们的广泛关注。脂肪间充质干细胞可应用于再生医学领域，用来替代和修复变性坏死的组织细胞。研究表明，脂肪间充质干细胞在无血清的培养条件下，通过转化生长因子的诱导作用，可以分化为软骨细胞。相反，在有血清的培养条件下，加入脂肪酸和地塞米松，可以将脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞。脂肪间充质干细胞具有自我更新的能力，并且能够分化成各种间充质组织细胞系。由于具有自我更新能力，当脂肪间充质干细胞被移植到组织受损部位或移植到生物材料上，这些细胞可以产生合适的组织架构。目前，国内外已经有大量的研究者进行了哺乳动物脂肪间充质干细胞的培养和药理学特性方面的研究，既往的研究多采用组织块培养法或者胰酶消化法。组织块消化方法消化不均匀，常存在未能完全消化的部分，同时多次吹打对细胞损害很大；同时组织块消化法分离的原代细胞培养时间长，且并非每一块都有细胞萌出，故细胞传代次数和最终获取的细胞数较少，细胞种类不纯，使进一步持续深入的研究受到限制。而胰酶消化法对细胞的损害比较大，尤其是在37度水浴的条件下，胰酶可以最大程度地发挥其消化效力，故对消化时间和消化次数的掌控较难；过度消化会导致细胞损伤，细胞膜破损，DNA溢出。所以，以往的研究人员会发现，消化之后的单细胞悬液非常粘稠，有时需要在消化液中加入DNA酶来打断溢出的DNA。这样导致的结果往往是，细胞数量非常少，且活力差。另外，上述的两种方法均存在分离过程中对污染的把控不彻底，而导致细胞或细菌等污染。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的一种高纯度、高活率、高活性同时低污染的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法。为了实现上述技术目的，本专利技术所采取的技术措施为：一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：步骤1：脂肪组织的预处理清理离体的脂肪组织块，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；步骤2：构造消化腔使用活检针刺入步骤1处理后的脂肪组织块，切取部分表面组织，丢弃，形成消化腔入口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内部脂肪组织并丢弃，造成脂肪组织块内部的消化腔；步骤3：酶消化使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养脂肪间充质干细胞使用注射器将消化腔内消化完毕的细胞液吸出，过70um筛网，进行离心洗涤，除去漂浮的脂肪和油脂，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到脂肪间充质干细胞，在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，上步骤1中清理离体的脂肪组织块包括清理脂肪组织块外部的血管和结缔组织的步骤；进一步优选地，还包括将脂肪组织块放入无菌纱布袋中的步骤。优选地，上述步骤2中使用的活检针为半自动或全自动活检针；更优选地，使用的活检针为MD半自动活检针。优选地，上述步骤3中复合酶消化液中各个酶的浓度均为1mg/ml。优选地，上述步骤3中酶消化过程为使用4℃复合酶消化液注入消化腔消化4-20h；可替换地，上述步骤3中酶消化过程也可以为使用37℃预热的复合酶消 化液注入消化腔消化10min-2h。优选地，上述步骤4中培养脂肪间充质干细胞的培养基为DMEM培养基。优选地，上述步骤4中培养脂肪间充质干细胞的培养基内还包括10％胎牛血清、5ug/ml胰岛素及1ug/ml地塞米松。优选地，上述双抗为青链霉素。另一方面，本专利技术还提供一种利用上述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法培养的人脂肪间充质干细胞及其相关应用。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：首先，在分离脂肪间充质干细胞的过程中，本专利技术在分离步骤开创性地使用活检针营造了一个消化腔，不但在用活检针打开通路(即消化腔入口)时去除了脂肪组织块表面杂细胞(包膜、结缔组织等)，而且形成了一个完全在脂肪组织块内部的消化腔，使得在后续的消化过程中，复合酶消化液得到了最大程度的利用，同时巧妙地避免了消化过程中的污染。其次，本专利技术在消化的过程中，在消化腔内部消化，使用注射器将消化后的液体吸出，这就意味着，吸出的细胞必定是消化完全的细胞，不存在组织块消化法中消化不完全的问题，同时本专利技术控制了消化的时间和温度，又是在整个组织块内部向外消化，故也杜绝了胰酶消化法存在的消化过度的问题。再次，本专利技术的分离培养方法自始至终均无需吹打，最大限度地保护了脂肪间充质干细胞的活力，使得培养得到的细胞活率高，活性好。最后，本专利技术消化采用特殊制备的复合酶消化液，复合酶消化液由I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶组成，消化效果好，消化更均匀透彻。综上所述，本专利技术的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的脂肪间充质干细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，具有较大的推广意义。附图说明图1为本专利技术的分离培养方法得到的人脂肪间充质干细胞显微照片(4X)。具体实施方式本专利技术提供了一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：步骤1：脂肪组织的预处理清理离体的脂肪组织块，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；步骤2：构造消化腔使用活检针刺入步骤1处理后的脂肪组织块，切取部分表面组织，丢弃，形成消化腔入口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内部脂肪组织并丢弃，造成脂肪组织块内部的消化腔；步骤3：酶消化使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养脂肪间充质干细胞使用注射器将消化腔内消化完毕的细胞液吸出，过70um筛网，进行离心洗涤，除去漂浮的脂肪和油脂，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到脂肪间充质干细胞，在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。实施例1本实施例采用手术切下的脂肪块为例，提取脂肪间充质干细胞，具体步骤和操作如下：步骤1：脂肪组织的预处理清理离体的脂肪组织块，清理离体的脂肪组织块包括清理脂肪组织块外部的血管和结缔组织，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗，然后将组织块放进无菌纱布袋，纱布袋上部留有活检针刺入口；步骤2：构造消化腔使用MD半自动活检针刺入步骤1处理后的脂肪组织块，切取部分表面组织，丢弃，形成消化腔入口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内 部脂肪组织并丢弃，造成脂肪组织块内部的消化腔，消化腔大小视组织块大小和需要采取的细胞量而定；步骤3：酶消化使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：脂肪组织的预处理清理离体的脂肪组织块，并利用含双抗和两性霉素B的D‑hanks溶液冲洗；步骤2：构造消化腔使用活检针刺入步骤1处理后的脂肪组织块，切取部分表面组织，丢弃，形成消化腔入口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内部脂肪组织并丢弃，造成脂肪组织块内部的消化腔；步骤3：酶消化使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养脂肪间充质干细胞使用注射器将消化腔内消化完毕的细胞液吸出，过70um筛网，进行离心洗涤，除去漂浮的脂肪和油脂，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到脂肪间充质干细胞，在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。

【技术特征摘要】
1.一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：脂肪组织的预处理清理离体的脂肪组织块，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；步骤2：构造消化腔使用活检针刺入步骤1处理后的脂肪组织块，切取部分表面组织，丢弃，形成消化腔入口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内部脂肪组织并丢弃，造成脂肪组织块内部的消化腔；步骤3：酶消化使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养脂肪间充质干细胞使用注射器将消化腔内消化完毕的细胞液吸出，过70um筛网，进行离心洗涤，除去漂浮的脂肪和油脂，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到脂肪间充质干细胞，在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤1中清理离体的脂肪组织块包括清理脂肪组织块外部的血管和结缔组织的步骤。3.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：何红葖，
申请(专利权)人：何红葖，
类型：发明
国别省市：上海;31