一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法技术

本发明专利技术涉及一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术经过人胎盘绒毛膜组织或脐带组织首次分离后组织的回收、人胎盘绒毛膜或脐带组织的间充质干细胞二次分离及间充质干细胞的体外培养和冻存，并对分离获得的细胞进行相关检测，与首次分离的细胞数量进行比较。本发明专利技术能够从已经分离过一次间充质干细胞的人胎盘绒毛膜组织或脐带组织中再次分离获得大量表型均一稳定的间充质干细胞，经检测符合临床应用标准。通过培养体外扩增获得大量间充质干细胞满足市场需求。

【技术实现步骤摘要】
一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法，特别涉及一种从人胎盘绒毛膜中二次分离间充质干细胞的方法，该方法同样适用于脐带间充质干细胞的二次分离。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。它首先在骨髓中发现，随后分别在脂肪、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在脐带、脐带血、胎盘组织中分离出来。由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，越来越多的临床研究表明间充质干细胞对很多疾病具有较好的缓解治疗效果，应用间充质干细胞治疗目前传统方法很难治愈的疾病已经得到普遍认可和接受，其在临床上的应用价值越来越大。作为要应用于临床细胞治疗的细胞产品，应当具有组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制，分离过程简单，细胞数量多等特点。而骨髓来源的MSC取材难，细胞增殖和分化能力受供体年龄限制，异体移植存在免疫排斥强等缺点，所以寻求一种来源丰富，干细胞含量高，数量多，取材方便，无创性并且不受伦理学限制的MSCs来源已然成为如今的研究热点。研究证明，人绒毛膜或脐带来源的间充质干细胞具有较好的自我更新和多向分化潜能，其免疫原性低，同种异体、异种异体移植不会发生免疫排斥反应，无致瘤性，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。脐带、胎盘绒毛膜组织来源于孕妇产后新生儿的脐带和胎盘组织，采集方便，胎盘组织具有一定的弹性，易于绒毛膜组织的剥离，因此脐带、绒毛膜是间充质干细胞的丰富来源之一。现有技术中，制备脐带、绒毛膜间充质干细胞的方法存在的不足之处：目前，脐带、绒毛膜间充质干细胞的分离方法有组织块培养法和酶消化法两种，两种方法中组织只应用一次，得到的细胞数量有限，很难满足目前市场对间充质干细胞的需求，而实际上分离一次后的组织当中仍含有大量的间充质干细胞残留，这无形中又造成了一种资源的浪费。另外，干细胞的培养成本较高，很多患者的经济条件很难承受间充质干细胞的治疗费用，这也在一定程度上限制了它的广泛应用。因此如何克服现有技术的不足是目前生物医药
亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种从已经利用过一次的人胎盘绒毛膜组织中较快的分离获得大量细胞形态均一、稳定、细胞活性好、可应用于临床的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，同时本方法也适用于从脐带组织中二次分离间充质干细胞，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法，包括如下步骤：步骤（1），组织收集：采用组织贴壁法分离培养围产期间充质干细胞至第一次传代时，收集培养瓶中的人绒毛膜组织或脐带组织；步骤（2），原代培养：将步骤（1）收集到的组织于间充质干细胞无血清培养基中静置培养3-4天，至细胞汇合度为50%以上；所述的培养条件为5%CO2、饱和湿度、37℃；步骤（3），更换培养基后继续原代培养：待步骤（2）培养至细胞汇合度为50%以上后，更换为新的培养基（即采用新的间充质干细胞无血清培养基更换旧的间充质干细胞无血清培养基），于5%CO2、饱和湿度、37℃条件下继续静置培养至细胞汇合度为60-90%；步骤（4），传代培养：待步骤（3）培养至细胞汇合度为60-90%后进行传代培养，弃掉原培养基及悬浮的组织，之后采用DPBS缓冲液清洗贴壁的细胞及组织，弃DPBS缓冲液及悬浮的组织，接着加入重组型胰酶消化细胞2-5min，待细胞开始收缩后加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶作用；然后采用移液管吹打细胞至细胞完全分散，将细胞悬液移至离心管中，离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，将接种细胞于新的细胞培养瓶中，置于5%CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱中培养；步骤（5），间充质干细胞的冻存：当步骤（4）培养的细胞汇合度达90%后进行细胞冻存，先弃原培养基，加入DPBS缓冲液清洗细胞，再用重组型胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶的作用，将细胞悬液移至离心管中，离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，混匀后将重悬溶液分装至冻存管中；步骤（6），冻存细胞缓慢降温：将步骤（5）得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，-80℃冰箱过夜放置，第二天转入-196℃液氮罐中长期储存；步骤（7），冻存细胞的复苏：从步骤（6）的液氮罐中取出冻存管后，置于37℃水浴锅中迅速融化，将细胞悬液移至装有DPBS缓冲液的离心管中，混匀后离心以去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于5%CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱继续培养。进一步，优选的是，步骤（1）中人绒毛膜组织或脐带组织的收集方法为：将采用组织贴壁法分离培养间充质干细胞至第一次传代时，将培养瓶中的组织块收集于离心管中，离心，去上清，备用。进一步，优选的是，所述的离心参数为300g、5min。进一步，优选的是，步骤（1）中人绒毛膜组织或脐带组织的收集方法为：将采用组织贴壁法分离培养间充质干细胞至第一次传代时，收集组织块后留下的物质（包括细胞和残留的组织）采用DPBS缓冲液清洗，之后加入重组型胰酶消化细胞2-5min，待细胞开始收缩后加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶作用；然后采用移液管吹打细胞至细胞完全分散，将细胞悬液移走，剩下的物质即为组织。进一步，优选的是，将细胞悬液移至离心管中，离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，将重悬溶液移至培养瓶中进行传代培养。进一步，优选的是，所述的离心参数为1200rpm、5min。进一步，优选的是，在普通光学显微镜下观察重组型胰酶消化细胞的情况，观察到细胞开始收缩，可用手轻拍细胞培养瓶将细胞拍散，之后再加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶作用。进一步，优选的是，步骤（4）的离心参数为1200rpm、5min，接种于新的细胞培养瓶中的接种浓度为1×105个/ml；步骤（7）冻存细胞的复苏中离心的参数为1200-1800rpm、5min。进一步，优选的是，第一次传代比例为1:2，即一个T-75培养瓶可传成2个T-75培养瓶。进一步，优选的是，步骤（7）中将细胞悬液移至DPBS缓冲液中混匀时，细胞悬液与DPBS缓冲液的体积比为1：5-10。优选原代培养组织接种时，组织：间充质干细胞无血清培养基的体积比优选为1:6。本专利技术原代培养时，组织应均匀的分布在细胞培养瓶底部。本专利技术所有培养过程中，应注意观察细胞生长状态，培养基营养不够或pH值不符时应及时进行补充或更换新的上述间充质干细胞无血清培养基。（pH值在6.5-7.5之间，优选为7.25），细胞密度达到要求应及时进行传代，以免影响细胞生长状态。本专利技术技术方案中两种收集方法收集到的组织，可以分别单独进行培养，也可以合并在一起进行培养，但不同来源的组织不可以合并在一起进行培养，（即绒毛膜组织不可以和脐带组织混在一起培养）。本专利技术使用重组胰酶溶液消化细胞的时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），组织收集：采用组织贴壁法分离培养围产期间充质干细胞至第一次传代时，收集培养瓶中的人绒毛膜组织或脐带组织；步骤（2），原代培养：将步骤（1）收集到的组织于间充质干细胞无血清培养基中静置培养3‑4天，至细胞汇合度为50%以上；所述的培养条件为5%CO

【技术特征摘要】
1.一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），组织收集：采用组织贴壁法分离培养围产期间充质干细胞至第一次传代时，收集培养瓶中的人绒毛膜组织或脐带组织；步骤（2），原代培养：将步骤（1）收集到的组织于间充质干细胞无血清培养基中静置培养3-4天，至细胞汇合度为50%以上；所述的培养条件为5%CO2、饱和湿度、37℃；步骤（3），更换培养基后继续原代培养：待步骤（2）培养至细胞汇合度为50%以上后，更换为新的培养基，于5%CO2、饱和湿度、37℃条件下继续静置培养至细胞汇合度为60-90%；步骤（4），传代培养：待步骤（3）培养至细胞汇合度为60-90%后进行传代培养，弃掉原培养基及悬浮的组织，之后采用DPBS缓冲液清洗贴壁的细胞及组织，弃DPBS缓冲液及悬浮的组织，接着加入重组型胰酶消化细胞2-5min，待细胞开始收缩后加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶作用；然后采用移液管吹打细胞至细胞完全分散，将细胞悬液移至离心管中，离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，将细胞接种于新的细胞培养瓶中，置于5%CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱中培养；步骤（5），间充质干细胞的冻存：当步骤（4）培养的细胞汇合度达90%后进行细胞冻存，先弃培养瓶中的培养基，加入DPBS缓冲液清洗细胞，再用重组型胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶的作用，离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，混匀后将重悬溶液分装至冻存管中；步骤（6），冻存细胞缓慢降温：将步骤（5）得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，-80℃冰箱过夜放置，第二天转入-196℃液氮罐中长期储存；步骤（7），冻存细胞的复苏：从步骤（6）的液氮罐中取出冻存管后，置于37℃水浴锅中迅速融化，将细胞悬液移至装有DPBS缓冲液的离心管中，混匀后离心，以去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加新的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫姗姗，李一佳，尹义强，刘国燕，
申请(专利权)人：云南舜喜再生医学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53