一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法技术

本发明专利技术属于间充质干细胞技术领域，具体涉及一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，其是从胎盘中提取人胎盘胎儿侧间充质干细胞得原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞；将原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞进行培养得第一代间充质干细胞，并进行冻存；收集不同个体的第一代间充质干细胞，复苏后进行体外培养至第六代，收集第二代到第六代无血清培养上清，检测其总抗氧化能力、清除自由基能力以及抗氧化酶类物质活性。本发明专利技术通过测定人胎盘间充质干细胞培养上清的抗氧化能力，进而推断间充质干细胞的总体抗氧化能力，不仅拓展了间充质干细胞在临床治疗方面的应用，且为临床上间充质干细胞的无细胞治疗提供了依据。

Method for detecting antioxidation ability of human placenta placenta mesenchymal stem cells

The invention belongs to the technical field of mesenchymal stem cells, in particular relates to a method for detection of human placental fetal mesenchymal stem cell antioxidant ability, which is extracted from human placenta and fetal mesenchymal stem cells of primary human placental fetal mesenchymal stem cells from the placenta; primary human fetal placenta the mesenchymal stem cells were cultured in the first generation of mesenchymal stem cells, and cryopreservation; collected independently of the first generation of mesenchymal stem cells after resuscitation were cultured to the sixth generation, second generation to the sixth generation of serum-free culture supernatant, the detection of total anti oxidative capacity, scavenging free radical the ability and antioxidant enzymes activity. Through the determination of human placenta derived mesenchymal stem cells culture supernatant of the antioxidant capacity, and then infer the mesenchymal stem cells of the overall antioxidant capacity, not only to expand the application of mesenchymal stem cells in clinical treatment, and clinical mesenchymal stem cells without cell therapy provides a basis for.

【技术实现步骤摘要】
一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法
：本专利技术涉及间充质干细胞
，特别涉及一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法。
技术介绍
：间充质干细胞(Mesenchymastemcell,MSCs)，由于其强大的抗氧化及抗炎能力，目前已得到广泛的关注。MSCs作为成体干细胞的一种，可以从多种组织细胞中分离出来，体外扩增后可用于人体疾病的治疗。间充质干细胞在抗氧化方面的应用，基于以下特性：(1)能够分泌抗氧化酶类物质抑制机体氧化反应；(2)能够分泌小分子物质清除机体氧化自由基。MSCs在体外无血清培养的过程中，可以分泌抗氧化酶类以及其他小分子物质释放到培养上清中。收集其培养上清进行抗氧化指标的检测，可以发现其具有一定抗氧化能力，并可以清除氧化自由基，但具体的抗氧化成分还有待研究。氧化应激是诸多疾病的始动因素。机体在遭受氧化损伤后，由于氧化应激作用会产生活性氧簇(Reactiveoxygenspecies,ROS)，其中主要包括清除二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)、羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2—)、一氧化氮离子(NO2—)、过氧化氢离子(H2O2)等。正常生理状况下，人体内自由基的产生和清除处于动态平衡状态，自由基也是人体不可或缺的物质，参与有氧呼吸电子传递，细胞信号传导和基因调控、诱导细胞增殖和凋亡、维持内环境稳态、维持个体的正常生长发育及抵抗细菌、病毒和癌症等方面起着重要作用。然而，当机体遭受外来刺激时，会导致机体遭受氧化应激，自由基就会大量产生打破平衡，而多余的自由基就会攻击生物膜引发一系列的自由基链反应，引发机体蛋白质，酶，脂质和核酸的氧化损伤，进而引发疾病。临床现已证明多种疾病与自由基相关，主要包括：(1)神经退行性疾病：帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病(HD)和中风等；(2)心脑血管疾病：动脉粥样硬化、高血压、缺血性心脏病等；(3)癌症：膀胱癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等癌症；(4)糖尿病，系统性红斑狼疮，骨质增生异常综合症，风湿性关节炎、白内障、哮喘、小儿肺炎，缺血再灌注损伤等其他疾病相关。因此，在治疗此类疾病时，针对其发病机制的抗氧化以及清除自由基方面的治疗变得尤为重要，或许可以推测，如果外界干预治疗可以清除机体多余的氧化自由基，便可以在根本上治愈此类疾病，疗效可以优于当前临床治疗上针对于疾病表现所采取的治疗措施，以“本”代“标”。当前关于间充质干细胞的大多数研究主要针对于间充质干细胞本身的抗炎作用以及其多向分化能力，而一些动物实验证明间充质干细胞同样具有抗氧化作用。SALLYM.SHALABY等人将大肠杆菌通过气管进入到大鼠体内，造成大鼠急性肺损伤模型，然后将骨髓来源的间充质干细胞通过尾静脉注射到大鼠体内，结果显示：间充质干细胞能明显减轻大鼠肺损伤，且接受间充质干细胞的实验组大鼠血清的抗氧化酶类物质，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等与对照组相比均有不同程度的提高。ShirongNi等也同样在体内实验中证实了间充质干细胞具有修复损伤肺组织的能力，且此修复能力是通过Nrf2抗氧化信号通路进行的。而究其作用机制，有些观点认为间充质干细胞的抗氧化能力是通过其旁分泌作用发挥功能的。间充质干细胞在分裂增殖的过程中，会向外周分泌微泡/外泌体，其表面携带小分子蛋白，此类小分子可以通过调控抗氧化信号通路来发挥抗氧化作用，或者分泌一些抗氧化酶类物质，酶类抗氧化物在铜、锌、锰、铁等辅因子的协助下通过分解或消除自由基以达到抗氧化的目的，此过程反应复杂、需多步才能完成，其间可能会引发自由基链反应，产生新的自由基或氧化物。因此，申请人认为不仅间充质干细胞在体内治疗中可以发挥作用，其在体外培养过程中将抗氧化活性物质分泌到培养基中，所得的培养上清也具有抗氧化作用。为此，提供一种检测间充质干细胞培养上清的清除自由基能力以及其中的抗氧化酶活性的方法。
技术实现思路
：本专利技术的目的旨在拓展间充质干细胞在临床治疗方面的应用，为临床上间充质干细胞的无细胞治疗提供依据，提供一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养所得上清抗氧化能力的方法。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，该方法是应用人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清作为实验对象，检测所述培养上清中人胎盘胎儿侧间充质干细胞分泌的抗氧化成分的抗氧化能力，从而间接推断出人胎盘胎儿侧间充质干细胞及其培养上清中的抗氧化能力，为其后期的研究及应用提供依据。上述检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，包括如下步骤：从胎盘中提取人胎盘胎儿侧间充质干细胞得原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞；将原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞进行培养得第一代间充质干细胞，并进行冻存；收集不同个体的第一代间充质干细胞，复苏后进行体外培养至第六代，收集第二代到第六代无血清培养上清，检测其总抗氧化能力、清除自由基能力以及抗氧化酶类物质活性。上述方法具体步骤为：(1)人胎盘间充质干细胞的分离从人胎盘中取得胎儿侧胎盘，将其剪碎后经过漂洗、离心、离心上清收集、过筛后得到原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞；(2)原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞的原代培养将原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养10～15天，待局部融合度达到80％后进行传代，得到第一代间充质干细胞，并进行冻存；(3)第一代间充质干细胞的传代培养复苏第一代间充质干细胞至培养皿中，使用无血清培养基培养至80％融合后收集上清，部分冻存后进行传代培养至第六代，每代次收集上清离心分装后于-80℃冻存，进行检测；(4)将检测得到的各组数据采用SPSS19.0统计软件，分别进行样本组与空白对照组相比，观察所得数据是否有统计学差异。上述检测内容主要包括：①总抗氧化能力(T-AOC)测定：上清中的抗氧化物质可以将Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳定的络合物，通过比色法测定出其抗氧化能力的高低。由于抗坏血酸/维生素C(VC)是已知并公认的抗氧化物质，故在预实验中首先检测出所得上清的大致范围，再用培养基配制成不同浓度的VC溶液，检测其抗氧化活性，然后选取其数值为上清抗氧化能力2倍左右的VC溶液作为后续实验的标准阳性对照，同时使用空白培养基作为阴性对照。正式实验中，采用此法分别检测对照组、VC组以及间充质干细胞上清的总抗氧化能力。②清除二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)能力的检测：DPPH·是一种以氮为中心的自由基，含有一个单电子，在517nm处有强烈的吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，加入培养上清后，测定清除DPPH·而引起的吸光度的减少可以反映其抗氧化能力的强弱。本实验采用此法分别检测对照组、VC组以及间充质干细胞上清的清除DPPH·自由基的能力。③抑制羟自由基(·OH)能力：羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，其性质很活泼，氧化各种有机物和无机物的速率极快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的主要因素，与机体衰老、肿瘤、辐射孙损伤和细胞吞噬能力有关。Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H202的量和Fenton反应产生的·OH量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，其特征在于：所述方法是应用人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清作为实验对象，检测所述培养上清中人胎盘胎儿侧间充质干细胞分泌的抗氧化成分的抗氧化能力，从而间接推断出人胎盘胎儿侧间充质干细胞及其培养上清中的抗氧化能力。

【技术特征摘要】
1.一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，其特征在于：所述方法是应用人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清作为实验对象，检测所述培养上清中人胎盘胎儿侧间充质干细胞分泌的抗氧化成分的抗氧化能力，从而间接推断出人胎盘胎儿侧间充质干细胞及其培养上清中的抗氧化能力。2.根据权利要求1所述的检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，其特征在于：所述方法，包括如下步骤：从胎盘中提取人胎盘胎儿侧间充质干细胞得原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞；将原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞进行培养得第一代间充质干细胞，并进行冻存；收集不同个体的第一代间充质干细胞，复苏后进行体外培养至第六代，收集第二代到第六代无血清培养上清，检测其总抗氧化能力、清除自由基能力以及抗氧化酶类物质活性。3.根据权利要求2所述的检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，其特征在于：所述从胎盘中提取人胎盘胎儿侧间充质干细胞是将胎盘剪碎后经过漂洗、离心、离心上清收集、过筛后得到原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞。4.根据权利要求2所述的检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，其特征在于：所述原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞的原代培养是将原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养10～15天，待局部融合度达到80％后进行传代，得到第一代间充质干细胞，并进行冻存。5.根据权利要求2所述的检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，其特征在于：所述第一代间充质干细胞的传代培养是复苏第一代间充质干细胞至培养皿中，使用无血清培养基培养至80％融合后收集上清，部分冻存后进行传代培养至第六代，每代次收集上清离心分装后于-80℃冻存，进行检测。6.根据权利要求2所述的检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，其特征在于：所述检测其总抗氧化能力、清除自由基能力以及抗氧化酶类物质活性得到的各组数据采用SPSS19.0统计...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏军，严秀蕊，刘晓明，付雪，张玉洁，
申请(专利权)人：宁夏医科大学总医院，
类型：发明
国别省市：宁夏,64