本发明专利技术提供了一种细菌脂多糖的沉降方法，它包括如下步骤：（1）取含有细菌脂多糖的溶液，冷冻至完全凝固，解冻；（2）将步骤（1）处理后的溶液进行低速离心，得到的沉淀，即为细菌脂多糖。本发明专利技术提供的细菌脂多糖的沉降方法简单，克服现有超速离心处理条件苛刻、成本高的缺陷，克服化学纯化需用大量化学试剂导致高成本且污染环境的弊端，具有广泛的实际应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌脂多糖的沉降方法，属于生物制品领域。
技术介绍
G_细菌在自然界广泛存在，能从水、土壤、动植物及人体中分离出G_细菌。细菌脂多糖(LPS)是G—细菌外膜的组成成分，其是由脂质A、核心多糖和0-侧链三部分组成。LPS会引起广谱非特异性的病理生理反应，比如发烧、白细胞数变化、弥散性血管内凝血、低血压、休克或者死亡，其抗原性很强，极小剂量的内毒素即可导致大部分动物死亡，因此，人用药物尤其是注射制剂需要对内毒素(热原质)限量，例如葡萄糖注射液、白蛋白、球蛋白、细胞因子、多糖类疫苗、蛋白类疫苗均要对产品进行热原质检测并控制在一定水平，超限热原质必须从产品中除去。另一方面，LPS是重要的保护性抗原，在各种动物模型中，LPS抗原表现出良好的免疫原性和免疫保护作用，可以将纯化的LPS制作成为疫苗，预防疾病发生。从含有LPS的溶液中除去或者纯化细菌脂多糖的方法包括化学纯化方法和物理分离方法，化学纯化是用乙醇、核酸酶、蛋白酶、丙酮等化学试剂纯化，成本高且污染环境。物理分离方法主要是超速离心分离方法，如，周炳荣等，“细菌内毒素(脂多糖)提取及纯化技术”，药用微生物学，药学情报通讯1989年第7卷第I期中LPS纯化方法即采用最常用的超速离心(4万转X4小时，共三次)，在这一条件下，LPS可沉淀下去，而蛋白质、核酸多糖则保留在上清液中，除去上清液即可得到较为纯化的LPS，经计算，4万转应大于15万g。超速离心的方法可以克服化学纯化方法的缺陷，但是因为超速离心的离心力大，通常大于100，OOOg,离心时间长，通常大于10h，处理量小，并且，现有技术中，离心力大于IOOOOOg的离心机的价格会显著高于离心力低于IOOOOOg的离心机，导致生产成本高，难以大规模工业应用。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种新的物理方式沉降细菌脂多糖的方法。本专利技术细菌脂多糖的沉降方法，它包括如下步骤(I)取含有细菌脂多糖的溶液，冷冻至完全凝固，解冻；(2)将步骤(I)处理后的溶液离心，得到的沉淀，即为细菌脂多糖。其中，步骤(I)所述冷冻的温度为-10 °C -80 °C。优选地，所述冷冻的温度为-20 0C -40。。。其中，步骤(I)所述解冻的温度大于0°C且小于80°C。优选地，所述解冻的温度大于0°C且小于等于70°C，可以保证蛋白制品不会失活。其中，步骤(2)所述离心条件是,离心力为100(T30000g,离心时间大于lOmin。优选地，所述离心力为6000g,离心时间为30 60min。其中，所述含有细菌脂多糖的溶液是细菌脂多糖提取液，或者污染细菌脂多糖的生物制品或药品。生物制品是指用基因工程、细胞工程、发酵工程等生物学技术制成的免疫制剂或有生物活性的制剂。所述细菌脂多糖提取液可以采用细菌脂多糖提取液的常用提取方法提取，如，采用三氯醋酸法、酚水法、高压超声处理法或者DMSO法。其中，DMSO是二甲基亚砜。所述污染细菌脂多糖的生物制品是疫苗、抗毒素、血清、免疫球蛋白、凝血因子、生长因子、干扰素或者白蛋白。本专利技术细菌脂多糖的沉降方法，先对细菌脂多糖的溶液进行冷冻和解冻后，仅需低速离心即可达到分离细菌脂多糖的目的，克服了传统物理分离细菌脂多糖需超速离心的缺陷，成本低廉，操作方便，具有良好的工业应用前景。 显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。具体实施例方式实施例I本专利技术细菌脂多糖的沉降方法取三氯醋酸法提取的细菌脂多糖提取液，-80°C下冷冻，10°C解冻，2000g离心60min，所得沉淀即为细菌脂多糖。实施例2本专利技术细菌脂多糖的沉降方法取酚水法提取的细菌脂多糖提取液，-10°C下冷冻，70°C解冻，30000g离心lOmin，所得沉淀即为细菌脂多糖。实施例3本专利技术细菌脂多糖的沉降方法取被LPS污染的人血白蛋白，-20 °C下冷冻，50 V解冻，6000g离心30min，沉淀即为除掉的细菌脂多糖。实施例4本专利技术细菌脂多糖的沉降方法取被LPS污染的疫苗，_50°C下冷冻，80°C解冻，4000g离心50min，沉淀即为除掉的细菌脂多糖。以下通过铜绿假单胞菌IATS分型系统的菌株实验，证明本专利技术有益效果实验例ILPS纯化铜绿假单胞菌购自ATCC (美国模式菌种保藏中心，American Type CultureCollection)，其保藏号为铜绿假单胞菌IATS 11型ATCC33358。I、实验方法(I)菌体收集铜绿假单胞菌IATS 11型ATCC33358菌株按常规方法培养。菌体制备可采用液体发酵或固体克氏瓶培养收集，在菌种启封、菌种检定后，进行细菌培养、杀菌脱毒，最后离心收集菌体。( 2 )酚水法提取LPSLPS的提取采用酚水法提取，首先用注射用水将菌体配制成20%的菌液，再加入等体积的事先配制好的90%苯酹液,置65 68°C水浴振荡提取60min,冷却后400(T8000rmp离心50min，抽取水相层LPS提取液，用预热至68°C注射用水补充提取液到原体积，重复提取3次。汇总水相层LPS提取液，再次离心后用进行透析，透析采用级别为纯化水以上的水液透析，每天换水2 3次,至少透析3天。(3)本专利技术方法处理透析结束后抽取5ml做定量细菌内毒素检测，其余收集起来并放置于_20°C低温冰柜，7d后将其转移至室温进行解冻，解冻完成后装于容量为IOOOml离心杯，每次离心6个离心杯，在6000g离心力的情况下离心50min。离心完成后，抽取5ml上清液做定量细菌内毒素检测，另取IOOml冻干瓶5个，每瓶装30ml上清液并进行冻干，冻干后分析核酸和蛋白质含量。取一个离心杯所得沉淀，用注射用水进行复溶至原体积1000ml,抽取5ml复溶液做定量细菌内毒素检测。细菌内毒素定量检测按中国药典2010版附录XII E细菌内毒素检测法中的动态浊度法进行；蛋白质含量检测按中国药典2010版附录XI B蛋白质测定法第二法Lowry法进行，牛血清白蛋白作为标准；核酸含量检测按中国药典2010版附录II A紫外-可见分光光度法进行；冻干制品水分检测按中国药典2010版附录XII D水分测定法第二法甲苯法进 行。2、实验结果经检测，检测结果见表I和表2 表I细菌内毒素定量检测结果_上清液_检测样品本专利技术方法本专利技术方法沉淀复溶液_1] _处理+前_处理后_ LPS测定值1523658 92316 1436579(EU/ml)_ 表2本专利技术方法处理后上清液冻干后各成分检测结果检测样品 _各成分含量(％)__3] _核酸_蛋白质_K 分 上清液冻千品_78.92_12.77_2.51上述数据表明，经本专利技术方法处理后，所得沉淀为LPS，所得上清液中，LPS大部分除去，除去率为94%，剩余部分主要成分为核酸和蛋白质，说明本专利技术方法可以充分沉淀LPS。实验例2LPS纯化铜绿假单胞菌购自ATCC (美国模式菌种保藏中心，American Type Cult本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细菌脂多糖的沉降方法，其特征在于：它包括如下步骤：（1）取含有细菌脂多糖的溶液，冷冻至完全凝固，解冻；（2）将步骤（1）处理后的溶液离心，得到的沉淀，即为细菌脂多糖。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢茂超，陈明拓，杨硕，姜晓，王学林，吴鸿舟，张雪梅，葛永红，
申请(专利权)人：成都生物制品研究所有限责任公司，成都蓉生药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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