【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及一种验证乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴度专属性的方法。
技术介绍
1、流行性乙型脑炎是一种人类中枢神经系统传染病，主要在亚太地区流行，死亡率在3％至30％之间。乙型脑炎减毒活疫苗的接种是预防控制该疾病的重要手段。蚀斑法是基于病毒感染细胞后导致细胞裂解形成的蚀斑，统计病毒蚀斑斑点的数量来分析病毒滴度的方法。该方法对乙脑病毒样品具有较好的适应性，具有检测效率高、操作简单及周期短等特点，是评价乙型脑炎减毒活疫苗中有效成分效价的常用方法。目前国内关于蚀斑法测定病毒滴度的方法验证多侧重于方法的重复性、精密度、准确性等，鲜有对病毒滴定方法专属性的研究。
2、专属性指有其他成分(杂质、降解物、辅料等)可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，具体是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。通常通过分析含有加了杂质、降解产物、有关化学物质或安慰剂成分的样品，将所获分析结果与未加前述成分之样品的测试结果进行比较，两组测试结果之差即专属性。乙型脑炎减毒活疫苗作为生物制品，在对其进行生物学测定时影响因素多，由于缺乏专属性考察，无法判断乙型脑炎减毒活疫苗辅料对蚀斑法测定乙型脑炎减毒活疫苗滴度的影响，进而影响到疫苗质量的控制。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种验证乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴度专属性的方法，它包括如下步骤：
2、1)制备试验组溶液：取乙型脑炎减毒活疫苗原液，加乙型脑炎
3、2)制备对照组溶液：取乙型脑炎减毒活疫苗原液，加病毒稀释液混匀，再用病毒稀释液溶按照10倍系列稀释成系列稀释度的溶液，作为对照组溶液；
4、3)制备中和组溶液：取乙型脑炎减毒活疫苗原液，用病毒稀释液按10倍系列稀释至10-3稀释度，再与乙型脑炎减毒活疫苗免疫血清等体积混合，中和后加病毒稀释液按10倍系列稀释至10-2稀释度，作为中和组溶液；
5、4)制备参考品溶液及空白溶液：分别取乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴度国家参考品和病毒稀释液，用病毒稀释液按照10倍系列稀释成系列稀释度的溶液，作为参考品溶液及空白溶液；
6、5)分别取步骤1)所得试验组溶液、步骤2)所得对照组溶液，步骤3)所得中和组溶液，步骤4)所得参考品溶液和空白溶液，接种于长成单层的bhk21细胞板，吸附后加营养覆盖物培养，再染色，数蚀斑计数计算病毒滴度。
7、进一步地，步骤1)所述乙型脑炎减毒活疫苗原液与乙型脑炎减毒活疫苗的辅料的体积比为1:1。
8、进一步地，所述辅料为乙型脑炎减毒活疫苗的稳定剂；所述稳定剂包括蔗糖乳糖溶液、尿素、人血白蛋白、明胶。
9、更进一步地，所述蔗糖乳糖溶液的浓度为10.5g/100ml，尿素的浓度为10g/100ml、人血白蛋白的浓度为10g/100ml、明胶的浓度为4g/100ml；所述蔗糖乳糖溶液中蔗糖和乳糖的质量比为任意比。
10、进一步地，步骤1)和步骤2)所述系列稀释度为10-4～10-6稀释度；步骤4)所述述系列稀释度为10-3～10-5稀释度。
11、进一步地，步骤2)所述乙型脑炎减毒活疫苗原液与病毒稀释液溶液的体积比为1:1。
12、更进一步地，所述病毒稀释液为mem必需氨基酸溶液。
13、进一步地，步骤5)所述bhk21细胞板每孔加0.2ml溶液，每个稀释度溶液2孔；吸附是37±1℃吸附90min，期间每30min取出轻摇1次；所述营养覆盖物4ml/孔；培养是37±1℃培养5天；染色是弃去孔中覆盖物，每孔加2-4ml 1％结晶紫染色15-30分钟。
14、更进一步地，所述营养覆盖物为含有1％甲基纤维素的mem必需氨基酸溶液。
15、进一步地，所述试验组溶液和对照组溶液的病毒滴度无差异，提示乙型脑炎减毒活疫苗制备时使用的蔗糖乳糖、尿素、人血白蛋白和明胶对蚀斑法检测乙型脑炎减毒活疫苗滴度无影响；参考品溶液的滴度在6.48～7.12lgpfu/ml，空白溶液无蚀斑提示专属性验证结果准确；中和组溶液无蚀斑说明蚀斑是由乙型脑炎病毒产生，提示专属性验证无干扰。
16、本专利技术验证乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴度专属性的方法，通过将乙型脑炎减毒活疫苗的辅料以特定的比例与乙型脑炎减毒活疫苗病毒原液混合，进行蚀斑法测试，能够确定测定结果是否受辅料干扰，并判断蚀斑法结果的准确性。将本专利技术方法应用于乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴定专属性验证，能有效控制乙型脑炎减毒活疫苗的质量，具有推广应用价值。
17、显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
18、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
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1.一种验证乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴度专属性的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)所述乙型脑炎减毒活疫苗原液与乙型脑炎减毒活疫苗的辅料的体积比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述辅料为乙型脑炎减毒活疫苗的稳定剂；所述稳定剂包括蔗糖乳糖溶液、尿素、人血白蛋白、明胶。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述蔗糖乳糖溶液的浓度为10.5g/100ml，尿素的浓度为10g/100ml、人血白蛋白的浓度为10g/100ml、明胶的浓度为4g/100ml；所述蔗糖乳糖溶液中蔗糖和乳糖的质量比为任意比。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)所述系列稀释度为10-4～10-6稀释度；步骤4)所述述系列稀释度为10-3～10-5稀释度。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤2)所述乙型脑炎减毒活疫苗原液与病毒稀释液的体积比为1:1。
7.根据权利要求1或6所述方法，其特征在于：所述病毒稀释液为MEM必需氨基酸溶液。>
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤5)所述BHK21细胞板每孔加0.2ml溶液，每个稀释度溶液2孔；吸附是37±1℃吸附90min，期间每30min取出轻摇1次；所述营养覆盖物4ml/孔；培养是37±1℃培养5天；染色是弃去孔中覆盖物，每孔加2-4ml 1％结晶紫染色15-30分钟。
9.根据权利要求1或8所述方法，其特征在于：所述营养覆盖物为含有1％甲基纤维素的MEM必需氨基酸溶液。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述试验组溶液和对照组溶液的病毒滴度无差异，提示乙型脑炎减毒活疫苗制备时使用的蔗糖乳糖、尿素、人血白蛋白和明胶对蚀斑法检测乙型脑炎减毒活疫苗滴度无影响；参考品溶液的滴度在6.48～7.12lgPFU/ml，空白溶液无蚀斑提示专属性验证结果准确；中和组溶液无蚀斑说明蚀斑是由乙型脑炎病毒产生，提示专属性验证无干扰。
...【技术特征摘要】
1.一种验证乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴度专属性的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)所述乙型脑炎减毒活疫苗原液与乙型脑炎减毒活疫苗的辅料的体积比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述辅料为乙型脑炎减毒活疫苗的稳定剂；所述稳定剂包括蔗糖乳糖溶液、尿素、人血白蛋白、明胶。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述蔗糖乳糖溶液的浓度为10.5g/100ml，尿素的浓度为10g/100ml、人血白蛋白的浓度为10g/100ml、明胶的浓度为4g/100ml；所述蔗糖乳糖溶液中蔗糖和乳糖的质量比为任意比。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)所述系列稀释度为10-4～10-6稀释度；步骤4)所述述系列稀释度为10-3～10-5稀释度。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤2)所述乙型脑炎减毒活疫苗原液与病毒稀释液的体积比为1:1...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖海棠，彭维，刘菊，马玉晓，江虹霞，曾兰义，罗明杰，吕冰凌，
申请(专利权)人：成都生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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