高产量的细菌多糖的制备制造技术

本发明专利技术提供了改进的培养、发酵及纯化条件，用于制备脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)多糖。本发明专利技术特别涉及一种新型发酵培养基、最佳料液添加策略以及用于获得高产量的脑膜炎奈瑟菌X多糖、没有使用任何色谱方法的改进的纯化方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高产量的细菌多糖的制备
本专利技术涉及对抗脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)的疫苗。
技术介绍
脑膜炎奈瑟菌是引起流行性细菌脑膜炎的原因。荚膜多糖是脑膜炎奈瑟菌的主要毒性决定性因素。13个脑膜炎球菌(meningococcal)血清组(serogroup)基于荚膜多糖的结构而分类，血清组A、C、Y和W135与脑膜炎链球菌疾病的大多数病例相关。在非洲的脑膜炎带，最大的疫情是由血清组A脑膜炎球菌引发的，而发达国家的偶发疾病和爆发通常由血清组B和血清组C脑膜炎球菌引发的。在上世纪90年代末期的美国，血清组Y脑膜炎球菌逐渐成为偶发疾病和爆发的重要原因，并且在2000年，血清组W135脑膜炎球菌引发了与哈吉朝圣(Hajjpilgrimage)有关的全球性的疾病，并且在非洲撒哈拉以南的地区大规模的爆发。血清组X脑膜炎奈瑟菌(人类X)，早期引起很少的脑膜炎偶发病例，最近被认为与脑膜炎球菌疾病的增加的发病率的相关，并逐渐被认为是引起非洲“脑膜炎带”大规模爆发的原因。尼日尔、布基纳法索、多哥和加纳记载了爆发，并且该爆发具有不同的规模。在2010年的脑膜炎季节，布基纳法索报告了超过6500例的脑膜炎病例，并且可以合理假设这些病例中至少有1000例由人类X引发，当地报告每十万人中就有120例。此前，在2007年的肯尼亚和乌干达的边界，许多患者被确诊患有人类X疾病，至少有82例细菌性脑膜炎。血清组B、C、Y和W135脑膜炎球菌的荚膜多糖由唾液酸衍生物组成。血清组B、C脑膜炎球菌分别表达(α2-8)和(α2-9)连接的唾液酸，而血清组Y、W135脑膜炎奈瑟菌表达D-葡萄糖或D-半乳糖的交替序列和唾液酸。相反，血清组A脑膜炎球菌的荚膜由(α1-6)连接的N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸组成，而脑膜炎奈瑟菌血清组X合成(α1-4)连接的N-乙酰葡糖胺-1-磷的荚膜聚合物。在过去的5年，在非洲脑膜炎带的人类X疾病的发病率增加，使得有必要在该区域的所选地方开发和引进人类X疫苗，以预防和控制未来的流行。将脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白偶联使单价(A或C)多糖偶联疫苗的开发具有高度有效性，并且从临床试验的免疫原性数据表明，广泛使用的覆盖血清型组A、C、Y和W-135的四价偶联疫苗可具有类似效果。类似手段对人类X也具有效果。参考OuliXiea等人“Characterizationofsize,structureandpurityofserogroupXNeisseriameningitidespolysaccharide,anddevelopmentofanassayforquantificationofhumanantibodies,Vaccine30,2012”.GunsteinNorheim论述目前没有对抗血清组X的疫苗，并且下一代可提供的疫苗应将目标设定为最常见的血清组：A、W-135和X。参见“PreventingtheemergingserogroupXmeningococcaldiseaseintheAfricanMeningitisBelt”OxfordVaccineGroup,2011。缺乏对抗X组脑膜炎球菌的疫苗，是在过去的几年里，由该血清组的脑膜炎球菌引起的爆发受到关注的一个原因。参考“Meningococcalvaccines:WHOpositionpaper”，2011年11月。为了促进基于人类X多糖的偶联疫苗的开发，有必要获得结构完整、高产量的人类X多糖。多种合成培养基被发现用于大规模生产脑膜炎球菌多糖(Frantz,I.D.Jr，GrowthRequirementsoftheMeningococcus.J.Bact。43：757-761，1942；Catlin,B.W.NutritionalprofilesofNeisserialactamica,gonorrhoeaseandmenigitidis,inchemicaldefinedmedia.J.Inf.Dis.，128(2)：178-194，1973；Watson-ScherpMedium：WatsonRG等人。ThespecifichaptenofgroupC(groupIIa)meningococcus,II.Chemicalnature.JImmunol，81，337-44，1958；MarceloFossadaPaz；JúuliaBaruque-Ramos；HaroldoHiss；MárcioAlbertoVicentin；MariaBetaniaBatistaLeal；IsaíasRaw.PolysaccharideproductioninbatchprocessofNeisseriameningitidesserogroupCcomparingFrantz,modifiedFrantzandCatlin6cultivationmedia,Braz.J.Microbiol，34(1)，圣保罗，2003年1月/4月。美国专利No.5,494,808公开了一种大规模、高细胞密度(5g/L的细胞干重，以及在600nm在10-13之间的光学密度)发酵方法，用于培养脑膜炎奈瑟菌(血清组B11)。该专利公开了下列培养基(称为“MC.6”)，用于培养脑膜炎奈瑟菌，用于分离OMPC(“外膜蛋白复合物(OuterMembraneProteinComplex”)。美国专利第7399615号中公开了一种发酵组合物，其中该组合物不含NH4Cl，以及一种发酵奈瑟菌属(血清组A、C、Y和W135)的改进的方法，该方法的发酵组合物中用大豆蛋白胨(HSP；Nutricepts公司；明尼苏达，Minn)代替氯化铵(氮源)。所述补料分批发酵(2L)，其中所述发酵培养基以及料液含有HSP-A，产生约为1300-1400mg/L的人类A多糖产量，平均最大OD在14-20之间。美国专利7491517公开了一种用于从脑膜炎奈瑟菌(血清组A、C、Y和W135)生产荚膜多糖的脑膜炎奈瑟菌极端培养基(Neisseriameningitidisfastidiousculturemedium,NMFM)，该极端培养基包含：DI(去离子)水，NaCl，K2SO4，KCl，二水柠檬酸三钠，MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O，MnCl2·6H2O，维生素B12，NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，盐酸硫胺，大豆蛋白胨，D-葡萄糖，L-谷氨酸，L-精氨酸，L-丝氨酸，甘氨酸，吗啉丙磺酸[MOPS]和CaCO3，以维持6.5到7.0的pH值，以及用于血清组A的Fe2(SO4)3和用于血清组W-135的NH4Cl。所述发酵产生约为30-40mg/L的多糖产量，平均最大OD为10。DavidBundle等人论述从脑膜炎奈瑟菌菌株247X(疾病控制实验室)中制备和分离人类X多糖，其中所述菌株在化学定义的培养基(NCDM)上生长18小时。所述发酵产生约为20mg/L的人类X多糖产量。参考“StudiesontheGroup-specificPolysacchrideofNeisseriameningitidesSerogroupXandimprovedProcedureforitsi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备具有高产量和高纯度的脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)荚膜多糖的新型方法，所述方法包括步骤：(a)制备含酪蛋白氨基酸的液体发酵罐营养培养基；(b)在所述发酵罐营养培养基中接种具有光学密度为0.8到1.2的脑膜炎奈瑟菌X菌种；(c)在OD值介于3和4之间时，开始以在10mL/hr/1.5L和60mL/hr/1.5L之间变化的加料速率连续指数添加料液；(d)在受控的pH、温度以及溶氧百分率条件下，培养经接种的所述发酵罐营养培养基；(e)当在590nm的光学密度(OD)小于最高培养菌OD的60％时，收获步骤(d)中产生的荚膜糖；(f)纯化在步骤(e)中得到的所述荚膜多糖；(g)可选的浓缩在步骤(f)中得到的所述纯化的荚膜多糖；以及其中，所述纯化的多糖具有300到550mg/L的产量、400到550KDa的平均分子量、60％到65％的纯化步骤回收率，并且含有小于0.5％的蛋白质/肽、小于0.5％的核酸和小于5EU/μg的内毒素。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.11.21 IN 3337/MUM/20121.一种制备具有高产量和高纯度的脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)血清组X荚膜多糖的新型方法，所述方法包括步骤：(a)制备含酪蛋白氨基酸的液体发酵罐营养培养基；(b)在所述发酵罐营养培养基中接种具有光学密度为0.8到1.2的脑膜炎奈瑟菌X菌种；(c)在OD值介于3和4之间时，开始以在10mL/hr/1.5L和60mL/hr/1.5L之间变化的加料速率连续指数添加料液；(d)在受控的pH、温度以及溶氧百分率条件下，培养经接种的所述发酵罐营养培养基；(e)当在590nm的光学密度(OD)小于最高培养菌OD的60％时，收获步骤(d)中产生的荚膜糖；(f)纯化在步骤(e)中得到的所述荚膜多糖；(g)浓缩在步骤(f)中得到的所述纯化的荚膜多糖；以及其中，所述纯化的多糖具有300到550mg/L的产量、400到550KDa的平均分子量、60％到65％的纯化步骤回收率，并且含有小于0.5％的蛋白质/肽、小于0.5％的核酸和小于5EU/μg的内毒素。2.如权利要求1中所述的方法，其中：(a)所述荚膜多糖生产菌选自脑膜炎奈瑟菌X菌株M8210，M9601，M9591，M9592，M9554，M2526，247X和5967；(b)所述发酵罐营养培养基含有：(i)5g/L到20g/L的酪蛋白氨基酸，0.14g/L到0.19g/L的氯化铵，10g/L到11g/L的右旋糖，5.8g/L到6g/L的氯化钠，0.9g/L到1g/L的硫酸钾，3.8g/L到4g/L的磷酸氢二钾，4.8g/L到5g/L的谷氨酸，0.2g/L到0.3g/L的L-精氨酸，0.4g/L到0.5g/L的L-丝氨酸，0.24g/L到0.25g/L的L-半胱氨酸，0.18g/L-0.19g/L的氯化镁，0.02g/L的氯化钙以及0.002g/L的硫酸亚铁，使得所述培养基的组分的浓度可变化±10％，或(ii)5g/L到10g/L的酪蛋白氨基酸，0.14g/L到0.17g/L的氯化铵，10g/L到11g/L的右旋糖，5.8g/L到6g/L的氯化钠，0.9g/L到1g/L的硫酸钾，3.8g/L到4g/L的磷酸氢二钾，4.8g/L到5g/L的谷氨酸，0.2g/L到0.3g/L的L-精氨酸，0.4g/L到0.5g/L的L-丝氨酸，0.24g/L到0.25g/L的L-半胱氨酸，0.18g/L-0.19g/L的氯化镁，0.02g/L的氯化钙以及0.002g/L的硫酸亚铁，使得所述培养基的组分的浓度可变化±10％(c)用具有光学密度为0.8到1的种子接种物对所述发酵罐营养培养基进行接种；(d)所述连续指数添加，当在590nm的OD介于3-4之间时开始以10mL/hr/1.5L的速率起始加料，该速率逐渐增加到30mL/hr/1.5L直到培养菌的OD达到最大，然后维持在60mL/hr/1.5L，直到培养菌的OD达到最大OD的50％时收获培养物；(e)所述料液含有72g/L到76g/L的右旋糖，38g/L到42g/L的谷氨酸钠，2.8g/L到3.2g/L的L-精氨酸，2.8g/L到3.2g/L的L-丝氨酸，1.9g/L到2.1g/L的L-半胱氨酸，1.9g/L到2g/L的氯化镁，0.13g/L到0.15g/L的氯化钙以及0.02g/L的硫酸亚铁，使得所述料液的成分的浓度可变化±10％；(f)所述培养在以下条件下(i)在36℃到37℃的温度，7到7.2的pH值，350-500rpm，15％到25％的溶氧百分率，1-1.5的气体流量，0到100％的空气以及0到100％的氧气条件下，进行7到10小时，或者(ii)在36℃的温度，7.2的pH值，400rpm，25％的溶氧百分率，1-1.5的气体流量，iv)，0-100％的空气以及0-100％的氧气的条件下，进行8到9小时；(g)灭活为使用1％的甲醛在37℃进行1到2小时，然后在10℃培养30分钟；(h)所述收获在以下条件下进行(i)在14500g离心45分钟去除所有细胞残留物；(ii)将上清液进行0.2μ过滤后，再进行100KD的...

【专利技术属性】
技术研发人员：皮萨尔·萨姆哈吉·尚卡尔，切洛克里·斯里尼瓦·雷迪，佩迪雷迪·斯里尼瓦·雷迪，
申请(专利权)人：印度血清研究所公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN