以海洋细菌为来源获取的κ-卡拉胶酶基因及重组酶制备方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学和基因工程领域，具体来讲涉及一种以海洋细菌为来源编码获取Κ‑卡拉胶酶基因的及重组酶制备方法。本发明专利技术包括如下步骤：一、PCR法获得海洋细菌中κ‑卡拉胶酶基因的全长序列；二、以海洋细菌为来源基因κ‑卡拉胶酶基因的重组表达质粒和重组菌株的构建；三、利用重组表达菌株表达重组κ‑卡拉胶酶；四、重组酶的活性检测。本发明专利技术通过一种新的、高效、准确的途径，以海洋细菌为来源获得的κ‑卡拉胶酶基因应用于大肠杆菌工程菌株的构建，并实现具有活性重组酶的异源表达，为实现工业化生产卡拉胶酶提供基础；通过本发明专利技术中的以海洋细菌为来源获得的κ‑卡拉胶酶基因，与已知κ‑卡拉胶酶序列相似性最高为44％。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及分子生物学和基因工程领域，具体来讲涉及一种以海洋细菌为来源编码获取Κ-卡拉胶酶基因的及重组酶制备方法。
技术介绍
：卡拉胶酶(Carrageenase)是一种海藻多糖水解酶，可降解卡拉胶的β-1,4糖苷键，生成系列偶数的卡拉胶寡糖。根据识别底物特异性，可将卡拉胶降解酶分为以下三种：κ-卡拉胶酶(EC 3.2.1.83)、ι-卡拉胶酶(EC 3.2.1.157)和λ-卡拉胶酶(EC 3.2.1.162)。κ-卡拉胶酶(κ-Carrageenase)属于糖苷水解酶GH16家族，该家族成员还包括昆布多糖酶、β-琼胶酶、内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶、内切β-牛乳糖苷酶和木葡聚糖转移酶等，它们有共同的保守核心催化区域E[ILV]D[IVAF][VILMF(0,1)]E序列。ι-卡拉胶酶(ι-Carrageenase)属于糖苷水解酶GH 82家族。具有DFGX3DGX6AX3A的糖苷酶保守区域。λ-卡拉胶酶(λ-Carrageenase)既不属于κ-卡拉胶酶的GH16，也不属于ι-卡拉胶酶的GH82，是一类新型的糖苷水解酶家族。卡拉胶酶主要来源海洋微生物，也有部分来源海洋软本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以海洋细菌为来源获取的κ‑卡拉胶酶基因，其特征在于，其核苷酸序列为Seq ID.NO.1，该基因DNA序列全长1488bp，编码495个氨基酸，含有45个氨基酸的信号肽序列。

【技术特征摘要】
1.一种以海洋细菌为来源获取的κ-卡拉胶酶基因，其特征在于，其核苷酸序列为Seq ID.NO.1，该基因DNA序列全长1488bp，编码495个氨基酸，含有45个氨基酸的信号肽序列。2.权利要求1所述的一种以海洋细菌为来源获取的κ-卡拉胶酶基因，其特征在于，从海洋细菌C.lytica M9中获取的方法包括如下步骤：(1)根据海洋细菌C.lytica M9中16s RNA序列构建系统进化树，找到与目的菌株最相近且具有全基因组数据的参考菌株；(2)根据基因组注释信息和NCBI中blast程序验证之后，找到参考菌株C.lytica DSM7489基因组中编码κ-卡拉胶酶的基因Celly_2915编号(gi|325284916:3333332-3334777蛋白序列ADY30732)，同时确定该参考菌株中编码κ-卡拉胶酶的相邻上游基因Celly_2914编号(gi|325284916:3332347-3333021蛋白序列ADY30731)和下游基因Celly_2916编号(gi|325284916:3335359-3336312蛋白序列ADY30733)及分别对应的核苷酸和氨基酸序列；(3)根据相邻上游基因Celly_2914和下游基因Celly_2916的氨基酸序列，通过BlocκMaκer在线软件程序进行比对和寻找保守核心区域，其中，Celly_2914的核心保守序列为：QGSINPM和Celly_2916的核心保守序列为：SGLGEPNE；(4)根据Celly_2914基因的核心保守序列设计正向引物，正向引物为：TCTTGCTTCGCTACCAGCTC；根据根据Celly_2916基因的核心保守序列设计反向引物，反向引物为：TTTGGCTCTCCCAAACCAGA；(5)PCR扩增，以目的菌株C.lytica M9基因组为模板，利用步骤(4)中所述的正反向引物经一步PCR方法扩增，扩增产物切胶纯化，获得含有编码完整κ-卡拉胶酶基因的原始编码序列。3.权利要求1所述的一种以海洋细菌为来源获取的κ-卡拉胶酶基因所编码的κ-卡拉胶酶，其特征在于，κ-卡拉胶酶的氨基酸序列为Seq ID.NO.2，属于糖苷水解酶GH16家族。4.根据权利要求3所述的κ-卡拉胶酶，其特征在于，通过下述步骤制备而成：1)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚子昂，吴海歌，赵博闻，崔红利，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21