一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，首先采用含刚果红的显色培养基进行初筛，获取产多糖细菌；进而采用菌落拉丝，通过拉丝效果进一步复筛，获取产高粘性多糖的细菌，最后，选用低氮源浓度的发酵培养基对通过前两轮筛选的细菌进行发酵培养，通过发酵液粘度变化测定，从而实现高粘性多糖胶细菌的判定，达到筛获目标细菌的目的。本发明专利技术提供的筛选方法工作量较少，具有更好的筛选方向性和覆盖全面性，以及更高的筛选效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细菌筛选
，特别涉及一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法。
技术介绍
微生物多糖种类众多，包括胞内多糖、胞壁多糖、胞外多糖等，其中，微生物胞外多糖因独特的理化特性、产量高、易与菌体分离而被广泛研究。近年来微生物胞外多糖已应用在食品、制药、日化等行业。而高粘性的微生物胞外多糖(透明质酸，还有假单胞菌属所产生的结冷胶、黄原胶、威伦胶等)在各行业各业的应用更为广泛。目前，微生物胞外多糖是由细菌和真菌发酵分泌提取，其中细菌多糖占有很大的份额，良好的生产菌种是微生物发酵产品企业的核心竞争力，因此，筛选出优良的高性能多糖生产菌株具有重大的现实意义和经济价值。现有技术中对产高粘性多糖胶细菌的筛选，通常是在菌种分离纯化后直接进行多糖发酵，由发酵液粘度来筛选目标菌株。该方法需要将所有待查菌株逐一进行液体发酵，工作量极大、筛选效率低。因此，有必要提供一种工作量小且能高效率地筛选出产高粘性多糖胶的目标细菌的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，先通过刚果红显色培养基上接种的菌落的颜色变化来快速甄别产多糖细菌，然后将产多糖细菌接种固体培养基，进而通过菌落拉丝评价筛获产粘性多糖细菌，最后将菌落粘性较好的菌株接种低氮发酵培养基进行培养，通过发酵液粘度变化筛获
产高粘性多糖的目标菌株。本专利技术提供的筛选方法的筛选效率高、工作量小，还可以具有良好的筛选方向性，真正获得目标细菌。本专利技术提供了一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，包括以下步骤：(1)平板显色法筛获产多糖的细菌：将细菌培养基与刚果红溶液混合后形成刚果红显示培养基，将所述刚果红显示培养基铺板，制成刚果红显色平板；取分离纯化后的待筛细菌，将所述待筛细菌分别在无菌环境下接种至所述刚果红显色平板上，20～37℃下静置培养24～48小时，观察菌落的颜色有无变深，若观察到菌落颜色变深，即为产多糖的细菌；(2)菌落拉丝法筛获产粘性多糖的细菌：将步骤(1)筛获的细菌接种于固体培养基上，在20～37℃下培养24～48h，待形成一定大小的菌落后，用无菌牙签接触菌落并轻轻向外拉丝，观察能否形成连续拉丝，若能形成连续拉丝，则为产粘性多糖的细菌；(3)低氮发酵筛获产高粘性多糖的细菌：将步骤(2)筛获的细菌接种至低氮发酵培养基中，在温度为20～37℃、振摇速度为150～300r/min下进行振荡培养120-168h，持续监测发酵液的粘度变化趋势，若发酵液的粘度持续升高，则判定产高粘性多糖的细菌，即获得目标细菌。本专利技术中，所述待筛细菌可以是来自不同环境的细菌经过营养富集、菌株纯化获得。可以来自于餐厨下水口、废弃水渠壁的细菌菌株等。所述纯化为本领域内的常规操作。可以是将保存于4℃条件下的待筛细菌样品，取1.0g与100ml LB液体培养基混合，20～37℃震荡4～8h，之后取1.0mL的震荡混合液与无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释液涂布在固体LB培养基上，20～37℃静置培养12～48h。挑取单菌落，进行划线纯化，获取并保存待筛菌株。本专利技术中采用刚果红作为显色剂制作显色平板，通过观察刚果红显色平板中接种的菌落颜色变化情况，初步筛选产多糖细菌。主要利用刚果红与细菌所产多糖类物质结合后呈现红褐色阳性反应，具备产多糖能力的细菌菌落颜色变
深，呈红褐色，而不产多糖的菌株则呈阴性，菌落颜色无明显变化。本专利技术中采用刚果红作为显色剂，相比于现有技术中采用含荧光染料(如革兰氏)或含苯胺蓝的培养基来显色而言，所述操作更简单快捷，无需提供荧光光源进行观察，也无需在培养完成后另加显色剂进行菌落染色。优选地，所述刚果红显色培养基包括：葡萄糖、酵母粉，蛋白胨，KH2PO4，MgSO4·7H2O，NH4NO3，琼脂，刚果红和水。进一步优选地，每1L所述刚果红显色培养基包括如下含量的各组分：葡萄糖2～20g，酵母粉0.5～5.0g，蛋白胨1.0～10g，KH2PO4 0.1～2.0g，MgSO4·7H2O0.1～0.5g，NH4NO3 0.1～2.0g，琼脂15～20g，刚果红：0.05～0.5g，其余为蒸馏水；所述刚果红显色培养基的pH为7.0～7.2。调节pH值是采用HCl和NaOH溶液。所述刚果红显色培养基的制备方法如下：取葡萄糖2～20g、酵母粉0.5～5.0g，蛋白胨1.0～10g，KH2PO4 0.1～2.0g，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g，NH4NO3 0.1～2.0g，琼脂15～20g，刚果红0.05～0.5g，加水至1L，调节pH至7.0～7.2，121℃下高压灭菌20min后，铺板，制成刚果红显色培养平板。优选地，步骤(1)中，所述铺板是将所述刚果红显示培养基铺在培养皿上。能够产生多糖的细菌种类较多，仅靠平板显色难以将筛选范围迅速缩小，对筛选效率的提高不明显，因此，需要进一步快速缩小筛选范围。微生物胞外多糖作为生物高分子，能使菌落具有较大的粘度，其在固体培养基上，产粘性多糖的细菌能形成表面粘稠或四周有扩散现象的菌落，在外力作用下呈现出拉丝状。根据拉丝长度即可初步判定菌落粘稠度，从而筛获可能具有产高粘性多糖能力的细菌。所述拉丝长度为1cm以上时，优选为3cm以上时，该菌落为粘丝菌落。优选地，在所述拉丝时，朝垂直于培养基的表面的方向向外拉丝。优选地，在每种细菌的4-6个菌落进行拉丝，每个菌落平行做2-3次。优选地，每1L所述固体培养基包括如下含量的各组分：葡萄糖2～20g，酵母粉0.5～5.0g，蛋白胨1.0～10g，KH2PO4 0.1～2.0g，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g，NH4NO30.1～2.0g，琼脂15～20g，其余为蒸馏水；所述固体培养基的pH为7.0～7.2。细菌所产的高分子聚合物中，除了多糖之外，糖蛋白、蛋白聚糖复合物也都有一定的粘度，通过菌落拉丝测试而筛选的细菌可能本身并不是产多糖的，因此，在筛选产高粘性多糖胶细菌的过程中，，仅靠菌落拉丝法难以实现良好的筛选方向性，需要进一步的筛选。本专利技术中，是对通过刚果红平板显色、菌落拉丝测试的细菌进行多糖发酵，以筛选出目标细菌。优选地，每1L所述低氮发酵培养基包括如下含量的各组分：蔗糖20～100g，牛肉膏0.1～2.0g，硝酸钠0～0.5g，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g，KH2PO4 0.1～1.0g，含微量元素的溶液1.0～5.0mL，其余为蒸馏水，所述低氮发酵培养基的pH为7.0～7.2；其中，所述微量元素包括铜、锌和钴。优选地，所述微量元素还包括锰、铁、钼和硼中的一种或多种。进一步优选地，所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各组分：MnCl2·4H2O0～2.0g/L，FeSO4·7H2O 0～5.0g/L，H3BO3 0～0.5g/L，CuCl2 10～50mg/L，ZnCl210～50mg/L，CoCl2·6H2O 1～10mg/L，NaMoO4·2H2O 0～50mg/L。微量元素溶液提前配制好，在使用时，每1L的培养基，加入1.0～5.0mL的含微量元素的溶液。更优选地，所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各成分：MnCl2·4H2O1.0～2.0g/L，FeSO4·7H2O 1～4.0g/L，H3BO3 0.1～0.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)平板显色法筛获产多糖的细菌：将细菌培养基与刚果红溶液混合后形成刚果红显示培养基，将所述刚果红显示培养基铺板，制成刚果红显色平板；取分离纯化后的待筛细菌，将所述待筛细菌分别接种至所述刚果红显色平板上，20～37℃下静置培养24～48小时，观察菌落的颜色有无变深，若观察到菌落颜色变深，即为产多糖的细菌；(2)菌落拉丝法筛获产粘性多糖的细菌：将步骤(1)筛获的细菌接种于固体培养基上，在20～37℃下培养24～48h，待形成一定大小的菌落后，用无菌牙签接触菌落并轻轻向外拉丝，观察能否形成连续拉丝，若能形成连续拉丝，则为产粘性多糖的细菌；(3)低氮发酵法筛获产高粘性多糖的细菌：将步骤(2)筛获的细菌接种至低氮发酵培养基中，在温度为20～37℃、振摇速度为150～300r/min下进行振荡培养120‑168h，持续监测发酵液的粘度变化趋势，若发酵液的粘度持续升高，则为产高粘性多糖的细菌，即获得目标细菌。

【技术特征摘要】
1.一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)平板显色法筛获产多糖的细菌：将细菌培养基与刚果红溶液混合后形成刚果红显示培养基，将所述刚果红显示培养基铺板，制成刚果红显色平板；取分离纯化后的待筛细菌，将所述待筛细菌分别接种至所述刚果红显色平板上，20～37℃下静置培养24～48小时，观察菌落的颜色有无变深，若观察到菌落颜色变深，即为产多糖的细菌；(2)菌落拉丝法筛获产粘性多糖的细菌：将步骤(1)筛获的细菌接种于固体培养基上，在20～37℃下培养24～48h，待形成一定大小的菌落后，用无菌牙签接触菌落并轻轻向外拉丝，观察能否形成连续拉丝，若能形成连续拉丝，则为产粘性多糖的细菌；(3)低氮发酵法筛获产高粘性多糖的细菌：将步骤(2)筛获的细菌接种至低氮发酵培养基中，在温度为20～37℃、振摇速度为150～300r/min下进行振荡培养120-168h，持续监测发酵液的粘度变化趋势，若发酵液的粘度持续升高，则为产高粘性多糖的细菌，即获得目标细菌。2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，每1L所述低氮发酵培养基包括如下含量的各组分：蔗糖20～100g，牛肉膏0.1～2.0g，硝酸钠0～0.5g，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g，KH2PO4 0.1～1.0g，含微量元素的溶液1.0～5.0mL，其余为蒸馏水，所述低氮发酵培养基的pH为7.0～7.2；其中，所述微量元素包括铜、锌和钴。3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述微量元素还包括锰、铁、钼和硼中的一种或多种。4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各成分：MnCl2·4H2O 0～2.0g/L，FeSO4·7H2O 0～5.0g/L，H3BO30～0.5g/L，CuCl2 10～50mg/L，ZnCl2 10～50mg/L，CoCl2·6H2O 1～10mg/L，NaMoO4·2H2O 0～50mg/L。5.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各成分：MnCl2·4H2O 1.0～2.0g/L，FeSO4·7H2O 1～4.0g\...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘陈立，张炳照，邵翅，邓誉峰，程传号，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44