一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法技术

本发明专利技术提供一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，包括以下步骤：取枯草芽胞杆菌菌落接入摇瓶培养；配制种子发酵培养基，其中种子发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7；将摇瓶种子液接入种子发酵培养基中发酵，培养8～13小时，得到种子罐菌液；配制液体发酵培养基，其中液体发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7；将种子罐菌液无菌转入液体发酵培养基中，培养22～31小时，放罐，得到枯草芽胞杆菌高密度发酵液。本发明专利技术的目的是提供一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，该方法生产的枯草芽胞杆菌活菌数多、芽孢形成率高、简便经济，适用于枯草芽胞杆菌的工业化规模发酵。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵工程领域，特别涉及一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法。
技术介绍
枯草芽胞杆菌是一类广泛存在的可产生芽孢的革兰氏阳性细菌，生长迅速，代谢旺盛，可产生脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等多种代谢产物，对人畜无害，不污染环境，在饲料、畜牧行业应用广泛。有些枯草芽胞杆菌还具有纤维素和半纤维素水解活性，可有效降解农作物秸秆和畜禽粪便，是有机物料腐熟剂的重要菌种来源。随着现代生活质量的提高和人们环保意识的增强，对绿色健康食品的需求越来越大，由于化学农药和化学肥料大量使用所带来的农药残留、环境污染等问题，使得生物防治在植物病害防控中的作用越来越突出。枯草芽胞杆菌可产生多种高效广谱抗生素，是植物病害防治中使用最广泛的微生物种群之一，与其他芽胞杆菌一起占据着全世界商业化应用的生物农药市场的二分之一。芽孢具有极强抗逆性、可抵抗高温、干旱、紫外线和有机溶剂等多种不良环境，使之在后续加工机械化生产及高温干燥的过程中，可以保证微生物制剂的活性，提高产品质量和贮存期。由于芽孢不是细菌生活史中不可缺少的部分，只是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆性休眠体，因此芽孢形成受很多因素影响，培养基所含碳源、氮源、无机盐的种类和配比，发酵参数如pH、温度、溶氧、发酵时间等都对芽孢形成具有重要作用，根据不同菌株，需要通过实验寻求最佳的适宜于芽孢形成的培养基配方并制定合理有效的发酵生产工艺。发酵液所含的有效活菌数是微生物制剂的重要生产指标，一方面关系到生产成本，另一方面也与制剂发挥功效直接相关。微生物制剂商业应用的关 键在于目标微生物的高效生产，目前关于枯草芽胞杆菌发酵，大多是在实验室摇瓶条件下进行，大规模工业化发酵生产研究较少，且存在有效菌数少或芽孢形成率低、发酵周期长、生产成本高等问题。
技术实现思路
本专利技术旨在解决上面描述的问题。本专利技术的目的是提供一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，该方法生产的枯草芽胞杆菌活菌数多、芽孢形成率高、简便经济，适用于枯草芽胞杆菌的工业化规模发酵。具体包括以下步骤：(1)取枯草芽胞杆菌菌落接入摇瓶培养，制成摇瓶种子液。(2)在种子发酵罐中配制种子发酵培养基，其中种子发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7。(3)将摇瓶种子液接入种子发酵培养基中发酵，其中，接种体积百分比为0.3～0.6％，发酵温度为30～35℃，种子发酵罐转速为180～200转/分，通气量为1:0.3～1:0.6，罐压为0.02～0.08Mpa，培养8～13小时，得到种子罐菌液。(4)在液体发酵罐中配制液体发酵培养基，其中液体发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7。(5)将种子罐菌液无菌转入液体发酵培养基中，其中，接种体积百分比为8～12％，发酵温度为30～35℃，液体发酵罐转速为150～175转/分，通气量为1:0.3～1:1.8，罐压为0.02～0.08Mpa，培养22～31小时，放罐，得到枯草芽胞杆菌高密度发酵液。其中，步骤(3)包括：接种体积百分比为0.5％，发酵温度为32℃，种子发酵罐转速为200转/分，通气量为1:0.5，罐压为0.03～0.06Mpa，培养9～12小时。步骤(5)包括：接种体积百分比为10％，发酵温度为32～35℃，液体发酵罐转速为170转/分，通气量为1:0.5～1:1.5，罐压为0.03～0.06Mpa，培养25～30小时。其中，种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.8～7.5。其中，种子发酵培养基和液体发酵培养基均包括以下组分和组分含量：葡萄糖0.8～1.0％，玉米粉0.8～1.2％，酵母粉0.3～0.5％，豆粕粉1.8～2.5％，CaCO30.2～0.5％，K2HPO40.1～0.3％，MgSO40.04～0.06％，MnSO40.02～0.03％，泡敌0.05～0.1％，其余为水。其中，葡萄糖、玉米粉、酵母粉、豆粕粉、CaCO3、K2HPO4、MgSO4、MnSO4的含量为质量百分含量，泡敌为体积百分含量。其中，种子发酵罐为500L种子发酵罐，种子发酵培养基为300L，液体发酵罐为5000L液体发酵罐，液体发酵培养基为3000L。其中，步骤(2)包括：对种子发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118～121℃，灭菌时间为30min，灭菌后的种子发酵培养基的初始pH值为6.5～7.7。步骤(4)包括：对液体发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118～121℃，灭菌时间为30min，灭菌后的液体发酵培养基的初始pH值为6.5～7.7。其中，步骤(1)包括：用灭菌接种铲铲取枯草芽胞杆菌菌落，接入摇瓶中的NA液体培养基，34℃，180转/分，震荡培养10～14小时，生长至OD6000.8～1.2，形成枯草芽胞杆菌摇瓶种子液。NA液体培养基的pH值为7.0～7.2，NA液体培养基包括：牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl5g，水1L。其中，步骤(1)之前还包括步骤：(11)将保存的枯草芽胞杆菌菌种进行活化。其中，步骤(11)包括：从保存枯草芽胞杆菌菌种的斜面蘸取少许菌落划线于NA固体平板，置于32℃培养箱培养30～48小时，至枯草芽胞杆菌长出形成菌落。其中，NA固体平板的培养基的pH值为7.0～7.2，NA固体平板的培养 基包括：牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl5g，琼脂粉20g，水1L。接种比例、发酵pH值、发酵温度、转速、通气量、罐压以及培养时间都均与最终放罐后发酵液的含菌量相关。其中，发酵温度、培养时间、接种比例和发酵pH值，均是影响菌株生长的条件参数，他们的数值适宜，是提高含菌量的重要条件；而转速和通气量则通过溶氧量，间接影响菌株的发酵环境，通气量和转速过高，泡沫增多，容易产生逃液和物质挥发，导致发酵液减少，通气量和转速过低，则溶氧量不够，因此，转速和通气量的取值是否合适，也影响最终发酵液的含菌量。另外，对于有氧发酵，发酵过程中需要通过滤后的空气，一般发酵罐维持一定的液位，液位上部空余部分保持一定的压力，这个压力即为罐压。罐压的目的包括：1.维持罐内正压，避免外界空气进入污染；2.一定的罐压可以增加溶氧量，有效的溶氧可以提升好氧菌发酵的效率。但是罐压增加，也相应提高CO2分压，对有些微生物的正常生长可能产生不利影响，并且浪费空气压缩动力，因此罐压也不能过大。罐压一般控制在0.04～0.06MPa，具体情况要视培养情况和设备条件来定，适宜的罐压，直接影响发酵液的发酵质量。另外，各发酵参数以及培养基中各营养素的含量和配比，还影响最终生产的菌群中芽孢体的含量。芽孢体具有极强抗逆性，能够保证芽胞杆菌在后续微生物制剂加工生产过程中，依然保持良好的活性，其含量是评判芽胞杆菌发酵的重要因素。本专利技术所提供的枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，通过控制各发酵参数和培养基的组成，具有以下有益效果：(1)本专利技术的发酵方法，以大量的实验为基础，通过设定适宜的发酵参数包括罐压、转速、通气量、接种比例、发酵pH值、发酵温度、培养时间等，使得最后制得的发酵液具有较高的含菌量，经过实验证明，最后发酵液中枯草芽胞杆菌的含菌量可以达到1.04×1010～1.24×1010CFU/mL。(2)本专利技术的发酵方法，通过配置合适的培养基以及发酵参数，使得最后制得的发酵液中枯草芽胞杆菌的芽孢含量达到9.2×109～1.12×1010C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取枯草芽胞杆菌菌落接入摇瓶培养，制成摇瓶种子液；(2)在种子发酵罐中配制种子发酵培养基，其中所述种子发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7；(3)将摇瓶种子液接入种子发酵培养基中发酵，其中，接种体积百分比为0.3～0.6％，发酵温度为30～35℃，种子发酵罐转速为180～200转/分，通气量为1:0.3～1:0.6，罐压为0.02～0.08Mpa，培养8～13小时，得到种子罐菌液；(4)在液体发酵罐中配制液体发酵培养基，其中所述液体发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7；(5)将种子罐菌液无菌转入液体发酵培养基中，其中，接种体积百分比为8～12％，发酵温度为30～35℃，液体发酵罐转速为150～175转/分，通气量为1:0.3～1:1.8，罐压为0.02～0.08Mpa，培养22～31小时，放罐，得到枯草芽胞杆菌高密度发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取枯草芽胞杆菌菌落接入摇瓶培养，制成摇瓶种子液；(2)在种子发酵罐中配制种子发酵培养基，其中所述种子发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7；(3)将摇瓶种子液接入种子发酵培养基中发酵，其中，接种体积百分比为0.3～0.6％，发酵温度为30～35℃，种子发酵罐转速为180～200转/分，通气量为1:0.3～1:0.6，罐压为0.02～0.08Mpa，培养8～13小时，得到种子罐菌液；(4)在液体发酵罐中配制液体发酵培养基，其中所述液体发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7；(5)将种子罐菌液无菌转入液体发酵培养基中，其中，接种体积百分比为8～12％，发酵温度为30～35℃，液体发酵罐转速为150～175转/分，通气量为1:0.3～1:1.8，罐压为0.02～0.08Mpa，培养22～31小时，放罐，得到枯草芽胞杆菌高密度发酵液。2.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：接种体积百分比为0.5％，发酵温度为32℃，种子发酵罐转速为200转/分，通气量为1:0.5，罐压为0.03～0.06Mpa，培养9～12小时；所述步骤(5)包括：接种体积百分比为10％，发酵温度为32～35℃，液体发酵罐转速为170转/分，通气量为1:0.5～1:1.5，罐压为0.03～0.06Mpa，培养25～30小时。3.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于，所述种子发酵培养基和所述液体发酵培养基的初始pH值均为6.8～7.5。4.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于，所述种子发酵培养基和所述液体发酵培养基均包括以下组分和组分含量：葡萄糖0.8～1.0％，玉米粉0.8～1.2％，酵母粉0.3～0.5％，豆粕粉1.8～2.5％，CaCO30.2～0.5％，K2HPO40.1～0...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琦，刘春红，李燕，张丽霞，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11