利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法技术

本发明专利技术提供一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，其是以刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68为发酵菌株，采用改良的发酵培养基，在26-30℃，转速150-220rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上的条件下进行发酵培养，从发酵液中提取多杀菌素。本发明专利技术从刺糖多胞菌发酵培养基的理化性质入手，提供一种多杀菌素产量稳定、起沫少的发酵培养基及补料方法。将发酵培养基中的大豆粉/豆饼粉用高温黄豆饼粉替代，实验表明，在发酵过程中高温黄豆饼粉较大豆粉和低温黄豆饼粉不易起沫，而高温黄豆饼粉较大豆粉和低温黄豆饼粉缺少的部分油脂可以在发酵中后期外源加入，此时加入即可以起到消沫的作用又解决了后期碳源不足的问题。

Method for producing multi bactericide by fermentation of polysaccharide of Acanthopanax

The present invention provides a method for using thorn production Saccharopolyspora spinosad fermentation, which is based on saccharopolysporaspinosa (Saccharopolyspora spinosa Z68) as the fermentation strain by improved fermentation medium at 26-30 DEG C, speed 150-220rpm, ventilation ratio 1:0.3-0.7, tank pressure 0.03-0.04MPa, fermentation dissolved oxygen control in 40% of the above conditions, spinosad extract from fermentation broth. The invention starts from the physical and chemical properties of the fermentation medium of the polysaccharide cell, and provides a fermentation medium and a feeding method for the stability of the production of the multi bactericide. The fermentation medium of soybean meal / cake powder by high temperature soybean meal replacement, experiments show that in high temperature fermentation soybean cake powder large flour and low temperature soybean meal is not easy to rise, while the high temperature soybean meal soybean meal and soybean cake powder at low temperature the larger the missing part of the oil can be added later in the fermentation of exogenous at this time, adding that can play the role of defoaming and solve the shortage of carbon source for later.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法。
技术介绍
多杀菌素，是刺糖多孢菌有氧发酵产生的次级代谢产物，属于大环内酯类化合物，其商业化产品中有效活性组分为多杀菌素A(85-90％)和多杀菌素D(10-15％)。多杀菌素没有抑菌活性，却有很好的杀虫活性，对鳞翅目和缨翅目害虫有较广的杀虫谱，对双翅目、鞘翅目和膜翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类有很好的防治作用，在防治鳞翅目害虫上，多杀菌素是现有杀虫剂中选择性最高的化合物之一，其活性与氯氰菊酯相当。多杀菌素具有高杀虫活性的同时，对非靶标生物则表现出低毒，它对哺乳动物、鸟类和有益昆虫毒性较低，对水生动物只有轻微的毒性，而且对哺乳动物无致癌、致畸、致突变或神经毒性的作用。多杀菌素在环境中通过多种组合途径降解，主要为光降解和微生物降解，降解产物为对环境无害的碳、氢、氧、氮等自然组分，且降解周期短，在土壤中多杀菌素光降解的半衰期为9-10天，在水中多杀菌素光降解的半衰期则小于1天，在叶面上多杀菌素光降解的半衰期是1.6-16天。与一般杀虫剂相比，多杀菌素具有见效快、无副作用、选择性高、对天敌安全、半衰期短、易降解、不易产生药物抗性等优点，是理想的高效低毒绿色农药，是治理抗性害虫的首选替代农药新品种。目前在我国，多杀菌素还未实现产业化，其中菌株发酵单位低，发酵周期长，成本高，发酵工艺控制复杂，分离纯化工艺不成熟都是制约其发展的因素。在微生物好气培养中，由于外力作用(通气和搅拌)、微生物的代谢及培养基的成分等原因往往会使发酵液产生许多泡沫，但是过多的泡沫会给发酵带来负面影响，如引起逃液不仅使工艺控制更加复杂还增加了染菌机会，而因泡沫液位变化在罐壁上形成的菌环会让发酵液中的菌体量减少，从而影响发酵效率。在多杀菌素发酵的过程中同样需要解决消沫问题。目前消除和控制泡沫主要有机械消沫和消沫剂两种方法。机械消沫普遍来说效率不高，而且不能消除引起泡沫的根本原因。而市售的化学类消沫剂(聚醚类消泡剂、硅酮类消沫剂、高级醇类消沫剂等)对多杀菌素的发酵影响均较大，此外大量消沫剂的加入也给后续多杀菌素提取工作带来困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种刺糖多胞菌发酵培养基，所述发酵培养基中含有如下组分：高温黄豆饼粉5-30g/L、玉米淀粉20-40g/L、葡萄糖30-50g/L、玉米浆15-20g/L和碳酸钙4-6g/L，以水配制。优选地，所述发酵培养基中还包括棉籽饼粉10-20g/L和/或酵母浸粉1-5g/L和/或豆油4-6g/L。本专利技术还提供一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，以刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)Z68为发酵菌株，采用权利要求1或2所述的发酵培养基，发酵条件为：26-30℃，转速150-220rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为168-216hr；发酵开始后第120hr内，第一次补加豆油和葡萄糖，豆油至终浓度10-30g/L，葡萄糖至终浓度10-40g/L；发酵开始后第120-192hr内，第二次补加葡萄糖至终浓度10-40g/L。优选地，发酵条件为：28℃，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为192hr。本专利技术中涉及的刺糖多胞菌为刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)Z68，该菌已在ZL201110224366.3中公开。本专利技术从刺糖多胞菌发酵培养基的理化性质入手，提供一种多杀菌素产量稳定、起沫少的发酵培养基及补料方法。将发酵培养基中的大豆粉/豆饼粉用高温黄豆饼粉替代，实验表明在发酵过程中高温黄豆饼粉较大豆粉和低温黄豆饼粉不易起沫，而高温黄豆饼粉较大豆粉和低温黄豆饼粉缺少的部分油脂可以在发酵中后期外源加入，此时加入即可以起到消沫的作用又解决了后期碳源不足的问题。附图说明图1为本专利技术实施例2中多杀菌素标准品的高效液相色谱图。图2为本专利技术实施例2中供试液高效液相色谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1刺糖多胞菌发酵培养基本实施例中，刺糖多胞菌发酵培养基的配方为：高温黄豆饼粉10g/L、玉米淀粉30g/L、葡萄糖30g/L、玉米浆20g/L、棉籽饼粉10g/L、酵母浸粉5g/L、碳酸钙5g/L和豆油5g/L，以水配制。灭菌前调培养基pH至7.0，121℃，灭菌30min。实施例2利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法以刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)Z68为发酵菌株，采用实施例1的发酵培养基，按5-15％(v/v)接种比例向上述发酵培养基中接种刺糖多胞菌种子液，进行发酵培养。发酵条件为：28℃，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为192hr。发酵开始后第96hr，第一次补加豆油至终浓度30g/L，补加葡萄糖至终浓度30g/L，发酵开始后第144hr，第二次补加葡萄糖至终浓度30g/L。其中，刺糖多胞菌种子液的制备方法为：挖取1cm2长满刺糖多孢菌的斜面菌苔，将其转接入盛有30mL灭菌的种子培养基的种子瓶中，在28℃，环境相对湿度为50-60％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，振荡培养，48-72小时，得到刺糖多胞菌种子液。种子培养基配方：糊精20g/L、葡萄糖10g/L、玉米浆6g/L、豆粕粉3g/L和硫酸镁2g/L，以水配制。种子培养基的pH值为7.0，121℃，灭菌30min。发酵液中多杀菌素含量分析：1)取发酵液1ml，加入9ml甲醇溶液，摇匀；2)超声波震荡20min，静止10min，使固液分层；3)取上层有机相，以0.45μm有机滤膜进行过滤；4)过滤后有机相作为供试液通过高效液相色谱仪进行效价检测；5)高效液相色谱条件：150×4.6mm(id)，5μm，不锈钢C18反相色谱柱；柱温35℃，流速1.0mL/min，以甲醇∶乙腈∶水(体积比为本文档来自技高网...

【技术保护点】
刺糖多胞菌发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中含有如下组分：高温黄豆饼粉5‑30g/L、玉米淀粉20‑40g/L、葡萄糖30‑50g/L、玉米浆15‑20g/L和碳酸钙4‑6g/L，以水配制。

【技术特征摘要】
1.刺糖多胞菌发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中含
有如下组分：高温黄豆饼粉5-30g/L、玉米淀粉20-40g/L、葡萄糖
30-50g/L、玉米浆15-20g/L和碳酸钙4-6g/L，以水配制。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培
养基中还包括棉籽饼粉10-20g/L和/或酵母浸粉1-5g/L和/或豆油
4-6g/L。
3.利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，以
刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)Z68为发酵菌株，采用权利
要求2所述的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：王书睿，周贤龙，
申请(专利权)人：牡丹江佰佳信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23