利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K制造技术

本发明专利技术公开了一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K

【技术实现步骤摘要】
利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法
本专利技术属于生物化工领域，尤其涉及利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法。
技术介绍
纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，经过发酵后可以得到多种生理活性物质，维生素K2，纳豆激酶，生物表面活性剂，生物多糖等。维生素K2(menaquinone，简写为MK，甲萘醌类)，是一种具有叶绿醌生物活性的萘醌基团衍生物，脂溶性维生素。依据C-3上异戊二烯侧链长度的不同，MK共有14种，通常以MK-n表示，其中n指的是侧链上异戊二烯单元的个数。MK-4，MK-7，MK-9生物活性均大幅高于维生素K1。维生素K2具有治疗和预防骨质疏松症，预防肝硬化进展为肝癌，强化肝脏的解毒功能，及治疗维生素K2缺乏性出血症等作用。维生素K2具有良好的促进凝血、预防和治疗骨质疏松的功效。但是国内外的维生素K2的生产，存在着原料成本高，产率低的问题，使得维生素K2的工业化生产受到了极大的制约，因此，降低发酵成本，或者增加发酵过程中的附加值，对维生素K2的发酵生产将起到极大的促进作用。纳豆激酶(nattokinase简写为NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶，是在发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilislnatto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。它由275个氨基酸按照固定排列方式组成，分子量是27724，结构为无空间折叠的线性氨基酸链，特征性作用底物为纤维蛋白，纳豆激酶能显著溶解体内外血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性。与其他具有纤溶活性的酶相比，纳豆激酶更容易被肠道吸收，溶栓作用也强于纤溶酶、尿激酶(UK)和蚓激酶，纤溶活性是纤溶酶的4倍。纳豆激酶在药品，保健品方面有极大的应用价值，但是也存在着发酵成本高，产率低的缺点。分析国内外的已有文献，纳豆芽孢杆菌可以发酵维生素K2，也可以发酵纳豆激酶。本专利技术首次专利技术了一种利用纳豆芽孢杆菌同时高产维生素K2和纳豆激酶的新方法，可以有效的提高纳豆芽孢杆菌发酵过程中附加值，提高发酵产率。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，采用优化得到联产培养基，使纳豆芽孢杆菌联产维生素K2和纳豆激酶的产量均达到较高水平，初步解决了维生素K2和纳豆激酶发酵过程中成本高，产量低的问题，并提高了原料的利用率促进了工业化进程。本专利技术通过以下技术手段达到上述技术效果：一种联产维生素K2和纳豆激酶的方法，以纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，优化培养基配方，包括菌种活化，制备种子，接种发酵培养基，控制发酵过程中纳豆芽孢杆菌的生长以及代谢产物维生素K2和纳豆激酶的生成，对发酵液中维生素K2和纳豆激酶进行分离；包括以下步骤：(1)菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，再取单菌落划线至试管培养基，进行培养；(2)制备种子：将试管中纳豆芽孢杆菌接种到种子培养基中培养；(3)纳豆激酶、维生素K2的生产：配制最佳联产发酵培养基，灭菌后冷却，再取步骤(2)制备的种子液接种到最佳联产发酵培养基中，于最佳联产培养条件下进行纳豆激酶和维生素K2的生产。(4)纳豆激酶、维生素K2的提取：将发酵液离心后，将上清与沉淀分离；分别提取纳豆激酶、维生素K2，并检测。优选地，所述步骤(1)中，平板培养基及试管培养基配方均为：蛋白胨5-7g/L，牛肉膏5-7g/L，氯化钠3-4g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于30-40℃待用；纳豆芽孢杆菌在平板培养基、试管培养基中的培养条件均为：培养温度35-40℃、培养时间24-48h。优选地，所述步骤(2)中，种子培养基配方为：葡萄糖7-10g/L，蛋白胨7-10g/L，氯化钠3-4g/L，调PH为7.2-7.4，121℃灭菌20分钟，放置于30-40℃待用；纳豆芽孢杆菌在种子培养基中的培养条件为：培养温度35-40℃，培养时间20-30h。优选地，所述步骤(3)中，通过对纳豆芽孢杆菌联产发酵培养基进行两个响应值的响应面优化，得到最佳联产发酵培养基的配方；通过对发酵条件进行单因素优化，得到最佳联产培养条件。优选地，所述步骤(3)中，最佳联产发酵培养基的配方为：大豆粉40-80g/L，玉米粉40-80g/L，大豆蛋白胨15-25g/L，牛肉膏10-20g/L，调PH为5.0-5.5；菌种接种量为5％-10％。优选地，所述步骤(3)中最佳联产培养条件为：先于第一联产培养条件下培养24-36h，再于第二联产培养条件下培养60-72h；所述第一联产培养条件为：培养温度37℃，转速500-700r/min，通气量1.5-2.0vvm；所述第二联产培养条件为：培养温度37℃，转速0-100r/min，通气量0.2-0.8vvm。优选地，所述步骤(4)中发酵液的离心条件为：9000-12000r/min，5-15min；所述离心后的上清用于纳豆激酶、维生素K2的提取，沉淀用于维生素K2的提取。优选地，所述步骤(4)中，从上清中提取纳豆激酶、维生素K2进行检测的具体方法为：搅拌条件下，于上清中添加0.2％-0.4％无机高分子絮凝剂，然后加入4％-8％的10g/L壳聚糖醋酸溶液，搅拌5-10min，静置0.5-1h后，最终获得分离后的维生素K2和纳豆激酶，其中，上清为纳豆激酶，絮凝沉淀为维生素K2，接着，分别对其进行检测；所述纳豆激酶的检测方法为：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法；所述维生素K2的检测方法为：上清中加入两倍体积正丙醇和正己烷混合物，震荡24h，高效液相色谱检测。优选地，所述无机高分子絮凝剂为聚合氯化铝、聚合硫酸铝、聚合氯化铁和聚合硫酸铁中的一种或多种的混合物。优选地所述步骤(4)中，从沉淀中提取维生素K2进行检测的具体方法为：将沉淀于60-70℃通风烘干后，加入3-8mL蒸馏水进行涡旋振荡，10000-15000r/min离心去上清，(-85)-(-75)℃温度下真空冷冻干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，静置24h，高效液相色谱检测。本专利技术的优点在于：(1)首次提出了维生素K2和纳豆激酶联产的方法，且发酵代谢过程易于控制，有利于产业化；(2)采用了益生菌纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，有利于维生素K2和纳豆激酶在食品工业生产方面的应用；(3)优化后的发酵培养基，发酵成本低，可以显著提高维生素K2和纳豆激酶的联产产率，是一种经济高效的方法；(4)采用优化后的分离手段，提高了发酵液中的维生素K2和纳豆激酶的分离效率，为产品的纯化奠定了基础。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，以纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，优化培养基配方，包括菌种活化，制备种子，接种发酵培养基，控制发酵过程中纳豆芽孢杆菌的生长以及代谢产物维生素K2和纳豆激酶的生成，对发酵液中维生素K2和纳豆激酶进行分离。包括以下步骤：(1)菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基(配方为：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠3g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于30℃待用)中培养，再取单菌落划线至试管培养基(配方为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K

【技术特征摘要】
1.一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，再取单菌落划线至试管培养基，进行培养；(2)制备种子：将试管中纳豆芽孢杆菌接种到种子培养基中培养；(3)纳豆激酶、维生素K2的生产：配制最佳联产发酵培养基，灭菌后冷却，再取步骤(2)制备的种子液接种到最佳联产发酵培养基中，于最佳联产培养条件下进行纳豆激酶和维生素K2的生产。(4)纳豆激酶、维生素K2的提取：将发酵液离心后，将上清与沉淀分离；分别提取纳豆激酶、维生素K2，并检测。2.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，平板培养基及试管培养基配方均为：蛋白胨5-7g/L，牛肉膏5-7g/L，氯化钠3-4g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于30-40℃待用；纳豆芽孢杆菌在平板培养基、试管培养基中的培养条件均为：培养温度35-40℃、培养时间24-48h。3.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，种子培养基配方为：葡萄糖7-10g/L，蛋白胨7-10g/L，氯化钠3-4g/L，调PH为7.2-7.4，121℃灭菌20分钟，放置于30-40℃待用；纳豆芽孢杆菌在种子培养基中的培养条件为：培养温度35-40℃，培养时间20-30h。4.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，通过对纳豆芽孢杆菌联产发酵培养基进行两个响应值的响应面优化，得到最佳联产发酵培养基的配方；通过对发酵条件进行单因素优化，得到最佳联产培养条件。5.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，最佳联产发酵培养基的配方为：大豆粉40-80g/L，玉米粉40-80g/L，大豆蛋白胨15-25g/L，牛肉膏10-20g/L，调PH为5.0-5.5；菌种接种量为5％-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑之明，王鹏，孙孝娟，刘会，赵根海，王丽，王晗，尉鸿飞，吴荷芳，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽,34