一种芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺制造技术

本发明专利技术提供了一种芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺，通过特定培养基组成及培养条件的配合来实现普切明的增产，所述培养基：葡萄糖10‑50g/L、酵母粉0.1‑2.0g/L、硫酸铵1‑10g/L、二水合柠檬酸三钠1‑18g/L、磷酸氢二钾0.10‑2.00g/L、硫酸镁0.1‑2.0g/L、氯化铁0.02‑0.30g/L、硫酸锰0.005‑0.50g/L、氯化钙0.1‑1.0g/L、吐温‑80 0.01％‑1％，pH7.0‑7.5；发酵培养条件：培养温度25‑40℃，摇床转速180‑240r/min，发酵时间24‑40h。并使用地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌进行发酵验证均实现了普切明的增产。本发明专利技术工艺具有组成简单、环保、经济、产量高、稳定且适用范围广的特点，具有一定应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于发酵工程
，特别是涉及一种芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺，该工艺高产、稳定表达且适用范围广。
技术介绍
普切明(pulcherrimin)是由两个L-亮氨酸以三价铁离子为载体脱水缩合形成的一种环二肽，即cyclo(L-Leu-L-Leu)衍生物，属于二酮哌嗪(Diketopiperazines，DKPs)家族中的一类化合物，其前体普切明酸分子式为C12H20N2O4，分子量256.2980，普切明分子式为C12H20N2O4Fe2/3，结构为(Kluyveretal,1953)，二酮哌嗪衍生物具有稳定的六元环骨架结构，使其在药物化学中成为一个重要的药效团，表现出广泛的生物活性和药理学活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤以及类似免疫抑制剂的活性。普切明是微生物发酵中产生的一种红棕色物质，该物质最早在酵母中发现，之后陆续在枯草芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌以及梅奇酵母属等中发现该物质(Uffenetal，1972；Mariaetal，2006；Kupferetal，1967；TurkelandEner，2009)。普切明结构为普切明作为二酮哌嗪衍生物的一种，也具有多种显著的生物活性和药理学活性，同时因其作为铁载体而形成的独特颜色，使得普切明也可作为一种天然色素，在医药、化妆品和印染等方面有很大的应用潜力。有研究表明普切明是由普切明酸与铁离子结合而成的网状结构，目前该物质最有效的鉴定方法之一是高纯度的普切明通过紫外光谱分析，其最大吸收波长为410nm，且有研究表明，242nm和280nm也是其特征吸收峰(Hongetal.,2003)。普切明的特性而具有生物防治作用已经引起大量研究者的兴趣。Pranithanchaietal.(2009)发现其可以减缓苹果腐败；Turkeletal.(2009)发现美极梅奇酵母对某些人体病原菌具有强烈的敌对作用，例如变形杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、毛孢子珠菌，除此之外，通过生防功能验证发现某些梅奇酵母属类菌对以下菌株也有敌对作用，例如黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、木霉菌、拟青霉、双极霉等。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺，该工艺通过特定的培养基成分与发酵条件配合，显著提高了普切明的产量。本专利技术提供了一种芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺，包括以下步骤：(1)种子培养：将芽胞杆菌接至种子培养基中进行种子培养得到发酵菌种；(2)发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：葡萄糖10-50g/L、酵母粉0.1-2.0g/L、硫酸铵1-10g/L、二水合柠檬酸三钠1-18g/L、磷酸氢二钾0.10-2.00g/L、硫酸镁0.1-2.0g/L、氯化铁0.02-0.30g/L、硫酸锰0.005-0.50g/L、氯化钙0.1-1.0g/L、吐温-800.01％-1％，pH7.0-7.5；所述发酵培养条件为：培养温度25-40℃，摇床转速180-240r/min，发酵时间24-40h；(3)将发酵液离心，去除上清液后得到菌体沉淀，经强碱溶解强酸沉淀、提取纯化得到目标代谢产物。本专利技术的有益效果是：本专利技术生产工艺简便、便于推广，特定的培养基成分与发酵条件配合能使芽胞杆菌代谢产物普切明含量大幅提升，便于后续的分离纯化。本专利技术工艺具有高稳定的特点，便于扩大规模生产。附图说明图1，不同吐温-80添加量对普切明产量影响图2，碳源类型对普切明产量影响；图3，不同葡萄糖浓度对普切明产量影响图4，氮源类型对普切明产量影响；图5，不同(NH4)2SO4浓度对普切明产量影响图6，无机盐K2HPO4浓度对普切明产量影响；图7，无机盐MgSO4浓度对普切明产量影响；图8，无机盐CaCl2浓度对普切明产量影响；图9，无机盐FeCl3浓度对普切明产量影响；图10，无机盐MnSO4浓度对普切明产量影响；图11，培养基中添加各浓度生长因子对普切明产量影响；图12，碳源-氮源-生长因子组合情况对普切明产量影响；图13，培养条件接种量对普切明产量影响；图14，培养条件种龄对普切明产量影响；图15，培养条件pH对普切明产量影响；图16，培养基组成及条件对不同芽胞杆菌生产普切明产量影响。具体实施方式本专利技术提供了一种芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺，包括以下步骤：(1)种子培养：将芽胞杆菌接至种子培养基中进行种子培养得到发酵菌种；(2)发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：葡萄糖10-50g/L、酵母粉0.1-2.0g/L、硫酸铵1-10g/L、二水合柠檬酸三钠1-18g/L、磷酸氢二钾0.10-2.00g/L、硫酸镁0.1-2.0g/L、氯化铁0.02-0.30g/L、硫酸锰0.005-0.50g/L、氯化钙0.1-1.0g/L、吐温-800.01％-1％，pH7.0-7.5；所述发酵培养条件为：培养温度25-40℃，摇床转速180-240r/min，发酵时间24-40h；(3)定量及检测：将发酵液离心，去除上清液后得到菌体沉淀，经将强碱溶解强酸沉淀、提取纯化得到目标代谢产物。并将上述提纯后的普切明加1mLNaOH溶解沉淀，使用紫外分光光度计在波长410nm下检测吸光度。由于碳水化合物的存在是诱导普切明合成的必要条件，合适的氮源能有效提高普切明合成所需底物氨基酸(亮氨酸)的合成效率；吐温-80的添加对普切明的合成和运输均起到了显著的促进作用；由于高含量的普切明对菌株自身生长有抑制作用，而添加生长因子(酵母粉)能够有效提高细胞浓度，对普切明合成起到积极作用；合适的无机盐成分配比保证了细胞的生长和胞内生化反应的正常运行，同时铁元素还是普切明合成的底物之一。所以本工艺根据芽胞杆菌的生长特点和普切明合成的特殊需求，有针对性的优化了培养基的关键组分，并通过正交实验取得了最佳的成分配比，形成了完整的发酵工艺，清液的合成培养基也使后续的产物分离纯化变得简单。优选的，步骤(1)所述芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中的一种或几种。更加优选的，步骤(1)所述芽胞杆菌包括：枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)168，保藏编号为ATCC23857；解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LX-12，保藏编号为CCTCCNo：M2015234,保藏日期：2015年4月15日，保藏中心：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)DW2，保藏编号为CCTCCNo：M2011344，中的一种或几种,保藏日期：2011年10月12日，保藏中心：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。在本专利技术的实施例中，以本专利技术提供的特定的培养基组成和培养条件对地衣芽胞杆菌DW2、枯草芽胞杆菌168、解淀粉芽胞杆菌LX-12进行发酵验证，均能得到普切明，且相对于原始培养基其普切明产量分别提高了883.8％、432.67％和694.15％，产量均显著提高。优选的，步骤(2)所述发酵培养条件还包括：接种量为1％-5％，种龄为6-14h，发酵pH6.5-8.0。优选的，所述种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺，其特征在于：包括以下步骤：(1)种子培养：将芽胞杆菌接至LB培养基中进行种子培养得到发酵菌种；(2)发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：葡萄糖10‑50g/L、酵母粉0.1‑2.0g/L、硫酸铵1‑10g/L、二水合柠檬酸三钠1‑18g/L、磷酸氢二钾0.10‑2.00g/L、硫酸镁0.1‑2.0g/L、氯化铁0.02‑0.30g/L、硫酸锰0.005‑0.50g/L、氯化钙0.1‑1.0g/L、吐温‑80 0.01％‑1％，pH7.0‑7.5；所述发酵培养条件为：培养温度25‑40℃，摇床转速180‑240r/min，发酵时间24‑40h；(3)将发酵液离心，去除上清液后得到菌体沉淀，经强碱溶解强酸沉淀后、提取纯化得到目标代谢产物。

【技术特征摘要】
1.一种芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺，其特征在于：包括以下步骤：(1)种子培养：将芽胞杆菌接至LB培养基中进行种子培养得到发酵菌种；(2)发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：葡萄糖10-50g/L、酵母粉0.1-2.0g/L、硫酸铵1-10g/L、二水合柠檬酸三钠1-18g/L、磷酸氢二钾0.10-2.00g/L、硫酸镁0.1-2.0g/L、氯化铁0.02-0.30g/L、硫酸锰0.005-0.50g/L、氯化钙0.1-1.0g/L、吐温-800.01％-1％，pH7.0-7.5；所述发酵培养条件为：培养温度25-40℃，摇床转速180-240r/min，发酵时间24-40h；(3)将发酵液离心，去除上清液后得到菌体沉淀，经强碱溶解强酸沉淀后、提取纯化得到目标代谢产物。2.如权利要求1所述的芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺，其特征在于：步骤(1)所述芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中的一种或几种。3.如权利要求2所述的芽胞杆菌高产普切明的发酵工艺，其特征在于：步骤(1)所述芽胞杆菌包括：枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)168，保藏编号为...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，李晓云，王冬，李顺意，马昕，杨勇，盛博杰，占杨杨，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42