一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法技术

一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，所述的芽胞杆菌为phop基因缺失的缺失株；所述的芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌或解淀粉芽胞杆菌。其制备方法如下：1)以芽胞杆菌基因组为模板，扩增phop的上下游片段，然后将该上下游片段连接起来；2)将连接好的phop上下游同源臂插入敲除载体，构建phop基因敲除载体；3)将构建的phop基因敲除载体电转化至芽胞杆菌，通过常规的基因敲除方法，得到phop缺失的芽胞杆菌。通过在相关芽胞杆菌中敲除phop，构建phop缺失重组菌株，可以显著提高芽胞杆菌生物量。其中，在液体发酵条件下，枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌的生物量分别提高了1.33倍、1.64倍和1.54倍。由此表明，phop的缺失可显著提高芽胞杆菌生物量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高芽胞杆菌生物量的芽胞杆菌，特别是提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法。
技术介绍
芽胞杆菌是广泛存在于自然界的一种革兰氏阳性菌，大多数的芽胞杆菌被认为是生物安全性菌株(GRAS)，通过芽胞杆菌发酵可以合成多种生物产品，如：细胞分裂素、絮凝剂、杆菌肽、聚γ-谷氨酸、地衣素、乙偶姻及丁二醇等。同时，芽胞杆菌也具有良好的外源蛋白分泌能力，具备成为良好外源蛋白表达宿主菌的条件。通过代谢工程改造和发酵工艺优化，芽胞杆菌可以高效合成多种生物化工产品，满足人类的不同需求。同时部分芽胞杆菌发酵还可以抑制枯萎病的发生。因此在芽胞杆菌的发酵生产中，无论是对于菌剂还是目标化合物的合成，单位时间内获得最多的生物量具有重要的意义，而微生物生物量更是微生物生理研究及其工业应用中必不可少的监测参数。Phop-phoR是芽胞杆菌中广泛存在一种重要的双组子调控因子，在低磷环境下，感应激酶PhoR可以自磷酸化，并且将获得的磷酸基团转移到调控因子Phop上，从而激活phop的表达水平。相关文献报道，基因phop对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中fengycin的合成具有正调控功能；PhoQ/PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号传导因子，其可以介导细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性。与此同时，相关研究也指出，phop也可以直接负调控氮代谢相关基因的表达，从而影响生物体对氮源的利用效率。phop的缺失可以显著提高细胞对氮源的利用水平，从而提高菌体的生物量。
技术实现思路
本专利技术提供了一种可以显著提高芽胞杆菌的生物量的基因工程改造方法。一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，针对芽胞杆菌，敲除其基因phop，获得phop缺失的芽胞杆菌缺失株。所述的芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌或解淀粉芽胞杆菌。制备所述提高生物量的基因工程改造芽胞杆菌的方法，其步骤如下：1)以芽胞杆菌基因组为模板，扩增phop基因上下游片段，然后将该上下游片段连接起来，形成phop上下游同源臂；2)将phop基因缺失片段插入敲除载体，构建phop基因敲除载体；3)将构建的phop基因敲除载体电转化至芽胞杆菌，通过同源双交换，得到phop缺失的芽胞杆菌。步骤1)中利用引物通过PCR的方法扩增出phop上下游同源臂序列A和B；所述的引物，其中枯草芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为Bs-phop-KF1/R1，Bs-phop-KF2/R2；地衣芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为Bl-phop-KF1/R1，Bl-phop-KF2/R2；解淀粉芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为Ba-phop-KF1/R1，Ba-phop-KF2/R2；步骤2)中通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用XbaI和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的质粒连接；所述的质粒为T2(2)-Ori质粒；步骤3)中通过电转法将质粒电转至芽胞杆菌。之后采用验证引物T2-F/R对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子抽质粒进行双酶切和测序验证；所述的液体发酵培养条件为，发酵温度25-45℃，250mL三角瓶中装液量20-100mL，摇床转速180r/min，发酵周期48h。附图说明图1为基因phop敲除载体的构建图(上下游同源臂扩增胶图)；图2为敲除载体转化枯草芽胞杆菌168菌落PCR验证图；图3为枯草芽胞杆菌168△phop敲除菌株构建验证PCR图；图4为枯草芽胞杆菌168及168△phop生长曲线；图5为地衣芽胞杆菌WX-02及WX-02△phop生长曲线；图6为解淀粉芽孢杆菌LX-12及LX-12△phop生长曲线；图7为枯草芽胞杆菌168及168△phop生物量；图8为地衣芽胞杆菌WX-02及WX-02△phop生物量；图9为解淀粉芽胞杆菌LX-12及LX-12△phop生物量。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的优越性作进一步说明，但不构成对本专利技术的限制。实施步骤一、芽胞杆菌中phop敲除载体的构建以枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)168(CCTCCNO：ATCC23857)为例介绍phop敲除载体的构建。根据枯草芽胞杆菌168的全基因组序列及调控因子基因phop序列，设计引物，引物分别为Bs-phop-KF1/R1，Bs-phop-KF2/R2，采用PCR的方法扩增出phop上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用XbaI和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(ori)质粒连接，转化DH5α。采用验证引物T2-F/R对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到phop的敲除载体。如下图1所示为基因phop敲除载体的构建图(上下游同源臂扩增胶图)，泳道2、3分别为phop的上下游同源臂A和B。泳道1：5KDNAmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。采用相同的方法构建了地衣芽胞杆菌WX-02，解淀粉芽胞杆菌LX-12中phop的敲除载体。枯草芽胞杆菌敲除载体引物：Bs-phop-KF1GCCGAGCTCAAAGGCGGAGGCGAAATCGTGBs-phop-KR1GTAGATCGGTTTTTTGGTATTGATTCTTCATCATCCACAACBs-phop-KF2GTTGTGGATGATGAAGAATCAATACCAAAAAACCGATCTACBs-phop-KR2GCTCTAGAAAATGCGGTACAAAGACTGGC地衣芽胞杆菌敲除载体引物：Bl-phop-KF1GCTCTAGACAGGTGCTCAGTTATTTGAGGGBl-phop-KR1GCTTTTTGCGGAGTCTTTGAAATTCCTGAAGAACCGTTATTGACBl-phop-KF2GTCAATAACGGTTCTTCAGGAATTTCAAAGACTCCGCAAAAAGCBl-phop-KR2CGGGATCCTGCCTACTTTTGTGCCTTCA解淀粉芽胞杆菌敲除载体引物：Ba-phop-KF1GCCGAGCTCTTATCCCGAAAGACCGTCBa-phop-KR1TTGGCTCCTCCAGTTTATCGCCCTCCGCTGTCTATTBa-phop-KF2AATAGACAGCGGAGGGCGATAAACTGGAGGAGCCAABa-phop-KR2GCTCTAGACGGGACGTCATGTTTGTAT实施步骤二、芽胞杆菌中phop敲除菌株的构建地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02中phop敲除菌株的构建，其方法和步骤与枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)168中phop敲除菌株类似。芽胞杆菌感受态的制备方法如下：首先在平板上活化菌种，然后挑菌至含有5mLLB的PA瓶中，37℃过夜培养，随后以5％的接种量转接至生长培养基中，37℃，200rpm培养至OD600到0.85左右，5500rpm离心6min收集菌体，用洗涤培养基重悬菌体，5500rpm离心6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于：针对芽胞杆菌，敲除其基因phop，获得phop缺失的芽胞杆菌缺失株。

【技术特征摘要】
1.一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于：针对芽胞杆菌，敲除其基因phop，获得phop缺失的芽胞杆菌缺失株。2.根据权利要求1所述的一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于，所述的芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌或解淀粉芽胞杆菌。3.根据权利要求1或2所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其步骤如下：1)以芽胞杆菌基因组为模板，扩增基因phop上下游片段，然后将该上下游片段连接起来，形成phop上下同源臂片段；2)将phop上下同源臂片段插入敲除载体中，构建phop基因敲除载体；3)将构建好的phop基因敲除载体电转化至芽胞杆菌中，通过同源双交换，得到基因phop缺失的芽胞杆菌。4.根据权利要求3所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于，步骤1)中利用引物通过PCR的方法扩增出phop上下游同源臂序列A和B。5.根据权利要求4所述一种提高芽胞杆菌生物量的基因工程改造方法，其特征在于，所述的引物，其中枯草芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的引物分别为Bs-phop-KF1/R1，Bs-phop-KF2/R2；地衣芽胞杆菌中用于上下游同源臂扩增的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，蔡冬波，师璐，李顺意，胡施颖，杨勇，魏子贡，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42