发明专利技术公开了一种利用短芽胞杆菌(Bacillus brevis，B.brevis)制备脑钠肽前体抗原表位的方法。该方法将能与脑钠肽前体抗体结合的脑钠肽前体N端线性抗原表位(NT‑BNP12‑21)核苷酸序列置换人纤维连接蛋白(fibronectin 3，Fn3)编码FG区的核苷酸序列，构成Fn3与NT‑BNP12‑21线性表位融合基因，插入到穿梭质粒pNCMO2的P2信号肽下游，构建pNCMO2‑Fn3‑NT‑BNP12‑21重组质粒，使得该重组质粒在B.brevis中能高效表达分泌型的骨架蛋白Fn3融合NT‑BNP12‑21线性表位的融合蛋白。本发明专利技术可以简单、快速、高效、低成本地制备分泌型的具有和脑钠肽前体抗原性相当的融合蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种利用高效表达分泌型蛋白表达系统制备人源纤维连接蛋白(Fn3)展示抗原脑钠肽前体N端(NT-BNP)线性表位的方法。
技术介绍
在ELISA检测试剂盒制备过程中，需要将相应的抗原作为标准品。其中，蛋白质类抗原占有很大的比例。如何高效生产蛋白质类抗原，是该类产品的一个技术关键。本专利技术采用人源纤维连接蛋白(Fn3)展示蛋白质类抗原线性表位，尝试建立一个利用短芽胞杆菌高效生产分泌型蛋白质类线性表位的通用平台。NT-BNP是当心肌受到刺激或损失时被释放到人的血浆中，在血浆中半衰期长，浓度高，体外更加稳定。因此，NT-BNP作为标准检测抗原目前被广泛地应用于心血管疾病的诊断治疗及预后应用中。NT-BNP作为标准检测抗原的来源包括化学合成、大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)重组、人细胞重组和心衰患者血浆分离等。由于其它几种来源成本较高，或者稳定性较差，目前主要来源为大肠杆菌重组获得。但大肠杆菌重组表达的融合蛋白，上游的蛋白表达需要IPTG诱导，下游的蛋白纯化需要破碎细胞等一系列的步骤，比较复杂。短芽孢杆菌(Bacillusbrevis，B.brevis)表达系统是能够高效表达分泌型和优良蛋白质的表达系统，尤其适用于生产分泌型蛋白质。该系统具有如下的优点：(1)没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单；(2)几乎不向胞外分泌蛋白酶，利于目的蛋白的稳定性；(3)对于真核起源的分泌型蛋白质，一般具有S-S键结构，据研究其发酵液中存在着可以促进蛋白中二硫键形成的因子，可以促进外源蛋白的折叠。本专利技术采用短芽孢杆菌表达人源纤维连接蛋白(Fn3)展示抗原脑钠肽前体线性表位，通过该途径可以将表达的外源蛋白直接分泌到培养液中，从而大大简化下游外源蛋白的分离纯化过程。可实现采用短芽胞杆菌分泌表达纤维连接蛋白所展示抗原的一个或多个表位，来生产具有和抗原蛋白等效的高稳定的抗原蛋白替代物。
技术实现思路
本专利技术提供一种利用分泌型蛋白表达系统短芽胞杆菌制备重组人源Fn3-N-端脑钠肽前体抗原表位(NT-BNP12-21)的方法，降低生产成本，实现快速、大规模分离制备人重组N-端脑钠肽前体抗原表位。本专利技术的技术方案为：将能与脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换人纤维连接蛋白Fn3的编码FG区核苷酸序列，再将以上融合基因构建到穿梭载体pNCMO2上，利用短芽胞杆菌表达系统高效表达重组人源Fn3-N-端脑钠肽前体抗原表位Fn3-BNP12-21。具体步骤如下：1.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP12-21线性表位融合蛋白表达载体构建：(1)将NT-BNP12-21线性表位设计在Fn3的FG区，在FGloop区引入编码BNP线性表位的短肽序列，构成人纤维连接蛋白Fn3与NT-BNP12-21线性表位融合基因Fn3-BNP12-21，合成Fn3展示NT-BNP12-21线性表位的基因片段，在融合基因5′末端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签，便于分离纯化；(2)将上述融合基因Fn3-BNP12-21通过NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点构建到穿梭载体pNCMO2的P2强启动子下游，形成融合表达载体pNCMO2-Fn3-BNP12-21；2.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP12-21线性表位融合蛋白的表达：(1)将融合表达载体pNCMO2-Fn3-BNP12-21转化至大肠杆菌中，在氨苄青霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆，氨苄青霉素在LB培养基的终浓度为100μg/ml，LB培养基配方为每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化钠10g和15g琼脂粉；(2)将鉴定过的阳性转化子转化至短芽孢杆菌中，在新霉素抗性的MT平板上筛选阳性克隆，新霉素在MT培养基终浓度为10μg/ml，MT培养基配方为每升培养基中含葡萄糖20g、多价胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO4·7H2O10mg、MnSO4·4H2O10mg、ZnSO4·7H2O1mg，pH＝7.2-7.4；(3)将鉴定过的阳性转化子接种在含有新霉素抗性的MT或2SY液体培养基中，新霉素在液体培养基终浓度为50μg/ml，过夜培养，收集上清培养液，利用SDS-PAGE电泳及WesternBlot法检测目的蛋白条带，2SY培养基配方为每升培养基中含葡萄糖20g、大豆胨40g、酵母提取物5g、CaCl2·2H2O0.15g，pH＝7.2-7.4；3.融合蛋白的分离纯化：收集上清培养液，用镍柱纯化带有His-Tag标签的融合蛋白，该蛋白即为重组人源Fn3融合N-端脑钠肽前体抗原表位BNP12-21蛋白。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用的表达载体为pNCMO2，该载体是在B.brevis和E.coli间的穿梭质粒。在E.coli中构建表达质粒后，转入B.brevis进行蛋白质表达。宿主菌细胞壁蛋白质的P2启动子作为pNCMO2的表达启动子，由于P2启动子在E.coli中不起作用，有利于目的基因的克隆；但在B.brevis中则是呈指数级别的强启动子，可高效的表达目的蛋白。本专利技术采用短芽孢杆菌表达人源纤维连接蛋白(Fn3)展示抗原脑钠肽前体线性表位，通过该途径可以将表达的外源蛋白直接分泌到培养液中，从而大大简化下游外源蛋白的分离纯化过程，从而快速、简单、高效的制备人重组N-端脑钠肽前体抗原表位。本专利技术不仅适用于分泌型人纤维连接蛋白-脑钠肽前体抗原表位的制备，也适用于其它重组蛋白质的制备。因此，本专利技术在大规模制备人源Fn3-BNP12-21重组蛋白和其它重组多肽的生产中具有较高实用价值。附图说明附图1为本专利技术的Fn3-BNP12-21基因结构图。附图2为本专利技术的pNCMO2-Fn3-BNP12-21融合表达载体图谱。附图3为本专利技术的Fn3-BNP12-21重组蛋白在不同培养基中表达的SDS-PAGE电泳图，其中：条带1、2、3为阳性转化子HB116-pNCMO2-Fn3-BNP12-21菌株在MT培养基中培养24h，离心所得上清样品，4、5、6为阳性转化子HB116-pNCMO2-Fn3-BNP12-21菌株在2SY培养基中培养24h，离心所得上清样品，M为标准蛋白质。附图4为本专利技术的Fn3-BNP12-21重组蛋白WesternBlot检测图结果图。其中，条带1为实施例一中的WesternBlot检测图结果，条带2为实施例二中WesternBlot检测图结果。附图5为本专利技术的Fn3-BNP12-21重组蛋白经镍柱纯化后SDS-PAGE电泳图，其中，条带1、2、3分别为实施例一至三所得的镍柱纯化后的Fn3-BNP12-21融合蛋白，M为标准蛋白质。附图6为本专利技术的重组Fn3-BNP12-21蛋白与鼠源抗BNP12-21氨基酸残基的单克隆抗体13G12结合能力分析。具体实施方式下面结合附图及具体实施方式对本专利技术作进一步的说明，但并不影响本专利技术的保护范围。实施例一1.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP12-21线性表位融合蛋白表达载体构建：(1)采用人纤维连接蛋白III型结构域蛋白(Fn3)为模式基因(EMBL登入号码AJ320527本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用短芽胞杆菌制备脑钠肽前体抗原表位的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、人纤维连接蛋白Fn3展示NT‑BNP12‑21线性表位融合蛋白表达载体构建：(1)将NT‑BNP12‑21线性表位设计在Fn3的FG区，在FG loop区引入编码BNP线性表位的短肽序列，构成人纤维连接蛋白Fn3与NT‑BNP12‑21线性表位融合基因Fn3‑BNP12‑21，合成Fn3展示NT‑BNP12‑21线性表位的基因片段，在融合基因5′末端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签，便于分离纯化；(2)将上述融合基因Fn3‑BNP12‑21通过NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点构建到穿梭载体pNCMO2的P2强启动子下游，形成融合表达载体pNCMO2‑Fn3‑BNP12‑21；2)、人纤维连接蛋白Fn3展示NT‑BNP12‑21线性表位融合蛋白的表达：(1)将融合表达载体pNCMO2‑Fn3‑BNP12‑21转化至大肠杆菌中，在氨苄青霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆，氨苄青霉素在LB培养基的终浓度为100μg/ml，LB培养基配方为每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化钠10g和15g琼脂粉；(2)将鉴定过的阳性转化子转化至短芽孢杆菌中，在新霉素抗性的MT平板上筛选阳性克隆，新霉素在MT培养基终浓度为10μg/ml，MT培养基配方为每升培养基中含葡萄糖20g、多价胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO4·7H2O 10mg、MnSO4·4H2O 10mg、ZnSO4·7H2O1mg，pH＝7.2‑7.4；(3)将鉴定过的阳性转化子接种在含有新霉素MT或2SY液体培养基中，新霉素在液体培养基终浓度为50μg/ml，过夜培养，收集上清培养液，利用SDS‑PAGE电泳及Western Blot法检测目的蛋白条带，2SY培养基配方为每升培养基中含葡萄糖20g、大豆胨40g、酵母提取物5g、CaCl2·2H2O 0.15g，pH＝7.2‑7.4；3)、融合蛋白的分离纯化：收集上清培养液，用镍柱纯化带有His‑Tag标签的融合蛋白，该蛋白即为重组人源Fn3融合N‑端脑钠肽前体抗原表位BNP12‑21蛋白。...
【技术特征摘要】
1.一种利用短芽胞杆菌制备脑钠肽前体抗原表位的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP12-21线性表位融合蛋白表达载体构建：(1)将NT-BNP12-21线性表位设计在Fn3的FG区，在FGloop区引入编码BNP线性表位的短肽序列，构成人纤维连接蛋白Fn3与NT-BNP12-21线性表位融合基因Fn3-BNP12-21，合成Fn3展示NT-BNP12-21线性表位的基因片段，在融合基因5′末端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签，便于分离纯化；(2)将上述融合基因Fn3-BNP12-21通过NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点构建到穿梭载体pNCMO2的P2强启动子下游，形成融合表达载体pNCMO2-Fn3-BNP12-21；2)、人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP12-21线性表位融合蛋白的表达：(1)将融合表达载体pNCMO2-Fn3-BNP12-21转化至大肠杆菌中，在氨苄青霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆，氨苄青霉素在LB培养基的终浓度为100μg/ml，LB...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡学军，孙慎侠，丁宁，杨春光，李连保，张婷，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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