一种电击转化短小芽胞杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种电击转化短小芽胞杆菌的方法，属于微生物DNA转化技术领域。本发明专利技术通过对短小芽胞杆菌电击转化条件的研究和探索，建立出最适合用于该菌的电击转化条件方案，大大提高了转化效率，有利于推进短小芽胞杆菌表达系统的研究进展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物DNA转化
，具体涉及一种电击转化短小芽胞杆菌的方法。
技术介绍
短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)为芽胞杆菌属细菌，属革兰氏阳性菌，是一种具有前景的可作为外源基因表达系统开发的宿主菌。短小芽胞杆菌在重组表达基因方面具备大肠杆菌表达系统无法比拟的优点，如：①蛋白表达产物可高效分泌到培养基中，而且在多数情况下，异源重组蛋白经芽胞杆菌分泌后便具有天然构象和生物活性；②该细菌在传统发酵工业中的应用已有几十年历史，无致病性、不产生内毒素，在国际科学界被认为是一种具生物安全性(GenerallyRecognizedasSafe，GRAS)的细菌；③分子遗传学背景清楚，生长迅速、培养条件简单；④具有独特细胞壁结构，蛋白产物的分泌能力很强，自身胞外蛋白酶活性水平远低于枯草芽胞杆菌。因此，短小芽胞杆菌非常适合外源蛋白的高效分泌表达，是一种潜在的比枯草芽胞杆菌更好的分泌表达宿主。针对短小芽胞杆菌的任何基因工程操作，都需要转化质粒或DNA片段至细胞内。与枯草芽胞杆菌一样，由于短小芽胞杆菌也不能形成感受态，因而采用电击转化法是最佳选择。在电击转化过程中，伴随电场强度增加，DNA进入受体细胞的效率会增大，但细胞死亡率也会相应提高，因而需要精巧平衡转化效率和死亡率的关系，这样才能增加获得阳性转化子的概率。目前国际上针对短小芽胞杆菌使用电击转化方法所获的转化效率很低(最高仅为～2×106cfu/μg)，因此通过对电击转化方法条件的研究与摸索，建立最适合用于短小芽胞杆菌电击转化的条件方案，是提高转化效率、突破转化效率瓶颈的必然途径，将大大推进短小芽胞杆菌表达系统的研发进度。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种电击转化短小芽胞杆菌的方法，是将保存的短小芽胞杆菌活化后，加入PEB电击缓冲液和待转质粒DNA，在特定条件下进行电击转化。电击转化结束后，在特定条件下进行复苏培养及涂布平板。最后随机挑取转化子进行鉴定。所述质粒DNA是任意的短小芽胞杆菌兼容质粒，所述短小芽胞杆菌是任意短小芽胞杆菌菌株。在本专利技术的上述实施方式中，所述将保存的短小芽胞杆菌活化方法，是将短小芽胞杆菌单菌落接入5mLLB培养基中，37℃中速振荡培养12～16h。以2％的接种量转接至50mLLB培养基中，250r/min摇菌至OD600为0.8～1.0。在本专利技术的上述实施方式中，所述PEB电击缓冲液的配方为272mmol/L蔗糖，1mmol/LMgCl2，7mmol/LK2HPO4，磷酸调节pH至7.4。在本专利技术的上述实施方式中，所述在特定条件下进行电击转化，是指加入质粒DNA使其终浓度为2.5μg/mL，冰浴10min；然后取此混合液200μL加入到0℃预冷过的电击杯中(电极距离0.2cm)，冰上放置，在电压2.0～2.5kV，电容25μF，电阻200Ω条件下电击。在本专利技术的上述实施方式中，所述在特定条件下进行复苏培养及涂布平板，是指电击结束后，立即加入800μLSOC培养基，37℃、150r/min培养3h。取200μL涂布于含抗生素的平板，37℃培养箱中培养16～24h。SOC培养基的配方为0.5％(W/V)酵母菌抽提物，2％(W/V)胰化蛋白胨，10mmol/LNaCl，2.5mmol/LKCl，10mmol/LMgCl2，20mmol/LMgSO4，20mmol/L葡萄糖。本专利技术相比现有技术的有益效果：据国内外现有公开文献报道，目前针对短小芽胞杆菌使用电击转化方法所获的最高转化效率为～2×106cfu/μg，应用本电击转化方法所获转化效率为5～7×106cfu/μg，已显著超越国际上已有报道的最高转化效率。附图说明图1：pBE-S质粒图谱图2：pHT01质粒图谱具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1pBE-S质粒转化短小芽胞杆菌W3菌株。短小芽胞杆菌W3菌株是我们实验室自行筛选并保存的一株菌株(保藏号：CCTCCNo.M2015018)。将短小芽胞杆菌W3单菌落接入5mLLB培养基中，37℃中速振荡培养12h。以2％的接种量转接至50mLLB培养基中，250r/min摇菌至OD600为1.0，置于冰浴20分钟，以4000r/min离心10min，弃上清，无菌加入等体积的PEB电击缓冲液悬浮，离心，重复2次，最后悬浮于0.8mLPEB溶液中。加入pBE-S质粒(图1)使其终浓度为2.5μg/mL，冰浴10分钟。然后，取此混合液200μL加入到0℃预冷过的电击杯中(电极距离0.2cm)，冰上放置，在电压2.1kV，电容25μF，电阻200Ω条件下电击。电击结束后，立即加入800μLSOC培养基，37℃、150r/min培养3h。取200μL涂布于含抗生素的平板，37℃培养箱中培养20h。随机挑取200个转化子，培养后进行鉴定，获得转化效率数据为6.1×106cfu/μg。实施例2pHT01质粒转化短小芽胞杆菌W3菌株。短小芽胞杆菌W3菌株是我们实验室自行筛选并保存的一株菌株(保藏号：CCTCCNo.M2015018)。将短小芽胞杆菌W3单菌落接入5mLLB培养基中，37℃中速振荡培养12h。以2％的接种量转接至50mLLB培养基中，250r/min摇菌至OD600为1.0，置于冰浴20分钟，以4000r/min离心10min，弃上清，无菌加入等体积的PEB电击缓冲液悬浮，离心，重复2次，最后悬浮于0.8mLPEB溶液中。加入pHT01质粒(图2)使其终浓度为2.5μg/mL，冰浴10分钟。然后，取此混合液200μL加入到0℃预冷过的电击杯中(电极距离0.2cm)，冰上放置，在电压2.2kV，电容25μF，电阻200Ω条件下电击。电击结束后，立即加入800μLSOC培养基，37℃、150r/min培养3h。取200μL涂布于含抗生素的平板，37℃培养箱中培养20h。随机挑取200个转化子，培养后进行鉴定，获得转化效率数据为5.4×106cfu/μg。实施例3pBE-S质粒转化短小芽胞杆菌ZJ1115菌株。短小芽胞杆菌ZJ1115菌株的保藏号为CGMCCNo.1.7925。将短小芽胞杆菌ZJ1115单菌落接入5mLLB培养基中，37℃中速振荡培养16h。以2％的接种量转接至50mLLB培养基中，250r/min摇菌至OD600为0.9，置于冰浴20分钟，以4000r/min离心10min，弃上清，无菌加入等体积的PEB电击缓冲液悬浮，离心，重复2次，最后悬浮于1.0mLPEB溶液中。加入pBE-S质粒(图1)使其终浓度为2.5μg/mL，冰浴10分钟。然后，取此混合液200μL加入到0℃预冷过的电击杯中(电极距离0.2cm)，冰上放置，在电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω条件下电击。电击结束后，立即加入800μLSOC培养基，37℃、150r/min培养3h。取200μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电击转化短小芽胞杆菌的方法，其特征在于，是将保存的短小芽胞杆菌活化后，加入PEB电击缓冲液和待转质粒DNA，在特定条件下进行电击转化。电击转化结束后，在特定条件下进行复苏培养及涂布平板。最后随机挑取转化子进行鉴定。所述质粒DNA是任意的短小芽胞杆菌兼容质粒，所述短小芽胞杆菌是任意短小芽胞杆菌菌株。

【技术特征摘要】
1.一种电击转化短小芽胞杆菌的方法，其特征在于，是将保存的短小芽胞杆菌活化后，加入PEB电击缓冲液和待转质粒DNA，在特定条件下进行电击转化。电击转化结束后，在特定条件下进行复苏培养及涂布平板。最后随机挑取转化子进行鉴定。所述质粒DNA是任意的短小芽胞杆菌兼容质粒，所述短小芽胞杆菌是任意短小芽胞杆菌菌株。2.根据权利要求1所述的短小芽胞杆菌活化方法，其特征在于，是将短小芽胞杆菌单菌落接入5mLLB培养基中，37℃中速振荡培养12～16h。以2％的接种量转接至50mLLB培养基中，250r/min摇菌至OD60...

【专利技术属性】
技术研发人员：管政兵，王凯强，陈宇，廖祥儒，蔡宇杰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32