The invention discloses a method for using single strand RNA in Monascus exogenous protein expression method of dormant spores, including Monascus culture and spore collection, Monascus spore pretreatment and the use of HDEN method of shock red Aspergillus spores in three steps, the way to bypass the germination of fungal spores this step, using HDEN power conversion technology, single stranded encoding protein RNA in vitro delivery through the cell wall and cell membrane, the protein expression in Monascus resting spores. The method of the invention has the advantages of simple and rapid process, excellent effect and high conversion rate of more than 90%.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
,具体涉及一种使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法。
技术介绍
分子生物学的中心法则是指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质,即完成遗传信息的转录和翻译的过程。现代基因工程中,常常使用宿主来表达外源蛋白,常用的做法就是构建质粒载体,把外源蛋白的编码DNA序列放在一个强启动子后面,导入宿主细胞后,编码DNA序列被转录成mRNA序列(单链RNA),mRNA序列又被细胞内的翻译机器表达成蛋白质分子,完成外源蛋白表达的全过程。DNA不论是作为游离于宿主基因组之外的质粒,还是插入到宿主基因组之中,都可以稳定地复制自身,并传递给子代。也就是说,DNA的信息可以遗传。同时,DNA可以源源不断地转录出新生RNA,并翻译成蛋白质。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种,即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。RNA作为单链分子,与双链结构的DNA相比,RNA很不稳定,半衰期很短,而且在自然界,RNA酶广泛存在,RNA非常容易被降解。RNA具有以下众所周知的特征:游离在细胞质的RNA不会遗传;RNA半衰期很短,不能长期存在;RNA不会插入到宿主的基因组DNA中。由于半衰期短,因此,一个RNA分子存在于细胞内的时长,也很短暂,该RNA只能在这个短暂的时间内,与核糖体相互作用,表达蛋白质分子。而被表达出来的蛋白质分子,也是有寿命的,一个蛋白质分子在细胞内存在多久,也可以用半衰期指标来衡量。在传统的基因工程技术中,如果要在一个宿主 ...
【技术保护点】
使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:1)红曲霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种红曲霉,培养至培养基表面长满红曲霉孢子,洗下培养基表面的红曲霉孢子,吸出孢子悬液并过滤去除菌丝,收集含有孢子的滤液,将滤液离心,收集沉淀的休眠孢子;2)红曲霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子,离心并收集孢子沉淀,重复上述重悬和离心步骤3‑4次后,将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中,得到孢子浓度为104‑1011个/ml的红曲霉孢子悬液;所述电击缓冲液由终浓度为0.01‑100mmol/L的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5‑5000mmol/L的甘露醇组成,电击缓冲液的pH为3.0‑9.5;3)使用HDEN法电击红曲霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的红曲霉孢子悬液以及待转化RNA,混匀,得到孢子与RNA混合物,将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min,然后采用Etta Biotech X‑Porator H1电转仪进行HDEN法电击,将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部,通电,使得孢子与RNA混合物内部产生电场,电击之后再将细 ...
【技术特征摘要】
1.使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:1)红曲霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种红曲霉,培养至培养基表面长满红曲霉孢子,洗下培养基表面的红曲霉孢子,吸出孢子悬液并过滤去除菌丝,收集含有孢子的滤液,将滤液离心,收集沉淀的休眠孢子;2)红曲霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子,离心并收集孢子沉淀,重复上述重悬和离心步骤3-4次后,将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中,得到孢子浓度为104-1011个/ml的红曲霉孢子悬液;所述电击缓冲液由终浓度为0.01-100mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5-5000mmol/L的甘露醇组成,电击缓冲液的pH为3.0-9.5;3)使用HDEN法电击红曲霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的红曲霉孢子悬液以及待转化RNA,混匀,得到孢子与RNA混合物,将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min,然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击,将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部,通电,使得孢子与RNA混合物内部产生电场,电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min,然后将孢子和RNA混合物吸出,得到导入外源RNA的休眠的红曲霉孢子;所述红曲霉悬液与待转化RNA的比例为:0.6-60000μl的红曲霉孢子悬液:0.1-10000μg的待转化RNA;所述电击参数如下:电压1-6000V,脉宽2-2000000ms,重复1-100次,每次间隔5-50000ms。2.根据权利要求1所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述步骤1)的培养基为PDA培养基、YPD培养基或察氏培养基。3.根据权利要求1所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述步骤1,)红曲霉的培养条件为:温度16-40℃,湿度15-85%,培养3-15日。4.根据权利要求1所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述步骤2)的红曲霉孢子...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。