一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法，包括黄曲霉培养和孢子收集、黄曲霉孢子预处理以及使用HDEN法电击黄曲霉孢子三个步骤，该方法绕过真菌孢子萌发这个步骤，采用HDEN电转化技术，将体外的单链编码蛋白RNA递送穿过细胞壁和细胞膜，在黄曲霉休眠孢子内表达蛋白质。本发明专利技术方法步骤简便快速，效果极佳，转化率达到90%以上。

Method for transforming exogenous ssRNA in germinated spores of Aspergillus flavus

The invention discloses a method for transforming in Aspergillus flavus ungerminated exogenous ssRNA spores, including Aspergillus flavus culture and spore collection, Aspergillus flavus pretreatment and the use of HDEN method of electric yellow Aspergillus spores in three steps, the method steps around the germination of fungal spores, using HDEN power conversion technology, single chain encoding protein RNA in vitro delivery through the cell wall and cell membrane, the protein expression in dormant spores of Aspergillus flavus. The method of the invention has the advantages of simple and rapid process, excellent effect and high conversion rate of more than 90%.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法。
技术介绍
分子生物学的中心法则是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。现代基因工程中，常常使用宿主来表达外源蛋白，常用的做法就是构建质粒载体，把外源蛋白的编码DNA序列放在一个强启动子后面，导入宿主细胞后，编码DNA序列被转录成mRNA序列(单链RNA)，mRNA序列又被细胞内的翻译机器表达成蛋白质分子，完成外源蛋白表达的全过程。DNA不论是作为游离于宿主基因组之外的质粒，还是插入到宿主基因组之中，都可以稳定地复制自身，并传递给子代。也就是说，DNA的信息可以遗传。同时，DNA可以源源不断地转录出新生RNA，并翻译成蛋白质。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。RNA作为单链分子，与双链结构的DNA相比，RNA很不稳定，半衰期很短，而且在自然界，RNA酶广泛存在，RNA非常容易被降解。RNA具有以下众所周知的特征：游离在细胞质的RNA不会遗传；RNA半衰期很短，不能长期存在；RNA不会插入到宿主的基因组DNA中。由于半衰期短，因此，一个RNA分子存在于细胞内的时长，也很短暂，该RNA只能在这个短暂的时间内，与核糖体相互作用，表达蛋白质分子。而被表达出来的蛋白质分子，也是有寿命的，一个蛋白质分子在细胞内存在多久，也可以用半衰期指标来衡量。在传统的基因工程技术中，如果要在一个宿主细胞内部表达外源的蛋白质，常用的做法是把蛋白质的编码基因构建在DNA载体上，把DNA载体转入宿主细胞内部，DNA载体源源不断地转录出编码蛋白质的RNA，RNA不断翻译出目的蛋白，实现了在细胞内的蛋白表达。如果不借助DNA载体，在体外制备编码蛋白的单链RNA分子，仅仅把编码蛋白质的外源单链RNA导入到宿主细胞内部，只要细胞内没有对应的DNA源源不断地转录出新的该RNA，那么，这个RNA与其所表达出的蛋白质分子，只能在特定的时间窗口存在。换言之,这个RNA与其所表达出的蛋白质分子，只能在细胞生命周期中的某一个时间段存在。因此，这个特性有个很重要的作用，可以在特定的时间周期窗口，瞬时表达某个蛋白或者RNA，可以实现表达蛋白质而不影响或者尽可能少影响细胞的正常生理周期和遗传信息。比如：可以在细胞生命活动的某个时间节点，转入外源RNA，表达某个细胞因子，调控细胞的生命周期；可以把TALENs、ZFNs和CRISPR/Cas9等Genome Editing的工具酶蛋白分子，用外源单链RNA在宿主细胞内做表达，避免使用质粒或其它DNA形式的载体时，将DNA序列引入细胞内部，并造成潜在的外源DNA与宿主染色体相互作用(例如同源重组)，影响细胞的遗传，等等。这个特性在基因工程领域，具有重要价值。在哺乳动物细胞实验中，已经有先例，可以把外源单链RNA直接转入哺乳动物细胞中。主要方法包括：1，使用诸如Lipo等试剂的化学法，Lipo等化学试剂可以与哺乳动物细胞的细胞膜发生相互作用，把外源RNA导入细胞内部。2，传统的电转化法，比如方波电击，这是一种用电脉冲短暂作用于接触外源RNA的哺乳动物细胞，使外源RNA进入细胞。黄曲霉，半知菌类，一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。它可用于产生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是酿造工业中的常见菌种。对其进行基因改造，需要在其细胞内表达外源蛋白，但是在这种真菌未萌发孢子中表达蛋白质非常困难。真菌孢子是真菌的主要繁殖器官，孢子呈休眠状态且可以生存很长时间。孢子在适宜的外界条件下，能够苏醒并萌发，形成菌丝而进行分裂繁殖。最为重要的是，很多类型真菌的孢子，是天然的单倍体，孢子是基因工程领域良好的起始生物材料。但是，由于孢子一般处于休眠状态，其细胞壁非常厚实，休眠孢子的细胞壁、细胞膜的状态，与萌发孢子、与菌丝体是不同的。且休眠孢子细胞内的生命活动也处于最不旺盛的状态，因此，本领域公知，休眠孢子的细胞通透性不如萌发孢子和菌丝，休眠孢子几乎不与外界交流物质，闭关锁国，一般处于睡眠状态。而萌发孢子或菌丝体，需要从外界吸收各种营养分子供给生命活动，因此细胞壁和细胞膜的通透性大于休眠孢子。所以，非常难以将外源RNA分子直接导入到睡眠孢子的内部。目前也尚未有任何方法可以做到直接把外源RNA分子在无介质介导的情况下，导入休眠的(未萌发)真菌孢子内部。这也是本行业内一直没有攻克的技术难题。目前尚未有把外源单链RNA导入黄曲霉细胞内部的报道，更没有把外源RNA导入黄曲霉孢子(无论是萌发孢子，还是未萌发孢子)的报道。目前用基因工程技术在黄曲霉细胞内表达目的蛋白质的方法，仍然需要借助DNA载体，且一般需要使用黄曲霉成熟菌丝体的原生质体作为宿主细胞，或者借助农杆菌作为介质，用DNA载体运载基因信息进入宿主细胞。此外，编码蛋白质的外源RNA导入未萌发孢子内部后，还需要与孢子内部的蛋白翻译因子等各种细胞因子、酶系相互作用，才能翻译出蛋白质分子。但是，众所周知，睡眠孢子的生命活动处于最不旺盛的状态，细胞内各种蛋白翻译因子和酶系的活力是很低的，各种因子和酶系分子的数量也是很少的，即便外源RNA进入了未萌发孢子内部，也需要比较长的相互作用时间，才能翻译出目的蛋白。而时间长，就意味着外源RNA在细胞内，被细胞内源性RNA酶降解的概率加大，因此，就要求要有足够多数量的外源RNA，可以进入未萌发孢子内部。如何让真菌的孢子萌发，本领域已经有现成的技术方案，但是无论哪种萌发方法，都需要消耗时间、精力、人工操作、以及化学试剂。业内已经有用萌发的真菌孢子，导入外源DNA的案例，因此，按照本领域的基础理论，一般认为，用细胞通透性更强的萌发孢子导入外源分子(例如外源的RNA)的成功率更大，因为萌发的孢子已经苏醒，细胞内各种因子和酶系已经充分调动和活跃起来了，细胞要吸收养分，细胞内外物质交流活跃。可惜的是，目前为止，尚未有用孢子(无论是萌发还是未萌发)导入外源编码RNA的先例。但是，显而易见，用未萌发的孢子来作为导入外源分子的起始材料，非常简便，因为可以省去做孢子萌发这一复杂的步骤，更重要的是，萌发的孢子，可能已经产生了多倍体，而未萌发的孢子，可以保证是单倍体，很多基因工程的应用，要求宿主细胞必须是单倍体，才能达到预想的结果或者效率。因此本专利技术尝试绕过真菌孢子萌发这个步骤，直接用休眠的孢子，来导入外源RNA。另外，众所周知真菌能产生大量的RNA酶，并且能够大量外分泌这些RNA酶，真菌是自然界RNA酶的主要来源之一。真菌孢子采集自菌体，采集真菌孢子时，孢子会携带有菌体分泌的大量的外源性RNA酶，而且很难在不杀灭孢子的情况下，把RNA酶彻底清洗干净(如果使用DEPC等化合物来做彻底清洗，势必会杀灭真菌孢子)。而且孢子自身也会产生和外分泌一些RNA酶。因此，使用外源单链RNA来转化真菌细胞，非常困难，无异于鸡蛋碰石头，单链RNA还未接触到真菌细胞就会被RNA酶降解了。综上所述，将编码蛋白质的RNA分子，直接导入真菌(无论是菌丝体还是孢子，无论是萌发的孢子还是未萌发的孢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1）黄曲霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种黄曲霉，培养至培养基表面长满黄曲霉孢子，洗下培养基表面的黄曲霉孢子，吸出孢子悬液并过滤去除菌丝，收集含有孢子的滤液，将滤液离心，收集沉淀的休眠孢子；2）黄曲霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子，离心并收集孢子沉淀，重复上述重悬和离心步骤3‑4次后，将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中，得到孢子浓度为104‑1011个/ml的黄曲霉孢子悬液；所述电击缓冲液由终浓度为0.01‑100mmol/L的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5‑5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0‑9.5；3）使用HDEN法电击黄曲霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的黄曲霉孢子悬液以及待转化RNA，混匀，得到孢子与RNA混合物，将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min，然后采用Etta Biotech X‑Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部，通电，使得孢子与RNA混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min，然后将孢子和RNA混合物吸出，得到导入外源ssRNA的休眠的黄曲霉孢子；所述黄曲霉悬液与待转化RNA的比例为：0.6‑60000μl的黄曲霉孢子悬液：0.1‑10000μg的待转化RNA；所述电击参数如下：电压1‑6000V，脉宽2‑2000000ms，重复1‑100次，每次间隔5‑50000ms。...

【技术特征摘要】
1.一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1）黄曲霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种黄曲霉，培养至培养基表面长满黄曲霉孢子，洗下培养基表面的黄曲霉孢子，吸出孢子悬液并过滤去除菌丝，收集含有孢子的滤液，将滤液离心，收集沉淀的休眠孢子；2）黄曲霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子，离心并收集孢子沉淀，重复上述重悬和离心步骤3-4次后，将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中，得到孢子浓度为104-1011个/ml的黄曲霉孢子悬液；所述电击缓冲液由终浓度为0.01-100mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5-5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0-9.5；3）使用HDEN法电击黄曲霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的黄曲霉孢子悬液以及待转化RNA，混匀，得到孢子与RNA混合物，将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部，通电，使得孢子与RNA混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min，然后将孢子和RNA混合物吸出，得到导入外源ssRNA的休眠的黄曲霉孢子；所述黄曲霉悬液与待转化RNA的比例为：0.6-60000μl的黄曲霉孢子悬液：0.1-10000μg的待转化RNA；所述电击参数如下：电压1-6000V，脉宽2-2000000ms，重复1-100次，每次间隔5-50000ms。2.根据权利要求1所述的一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法，其特征在于：所述步骤1）的培养基为PDA培养基、YPD培养基或察氏培养基。3.根据权利要求1所述的一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法，其特征在于：所述步骤1，）黄曲霉的培养条件为：温度16-40℃，湿度15-85%，培养3-15日。4.根据权利要求1所述的一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法，其特征在于：所述步骤2）的黄曲...

【专利技术属性】
技术研发人员：林峻，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35