同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及其应用。它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条的检测线上分别上包被黄曲霉毒素‑牛血清白蛋白偶联物和甲萘威‑卵清白蛋白偶联物；所述的抗甲萘威单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生的。其可用于样品中黄曲霉毒素、甲萘威含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。

Simultaneous detection of aflatoxin and carbaryl mixed pollution time resolved fluorescence immunochromatographic kit, preparation method and Application

The invention relates to a method for simultaneous detection of aflatoxin and carbaryl mixed pollution time resolved fluorescence immunochromatographic kit, preparation method and application thereof. It includes the carbaryl monoclonal antibody immunochromatographic test strip and time-resolved fluorescence containing europium labeled anti aflatoxin monoclonal antibody, europium labeled lyophilized samples reaction bottle products including: the time immunochromatographic test strip line detection resolution fluorescence were covered by aflatoxin bovine serum albumin conjugates and carbaryl ovalbumin conjugate; the anti carbaryl monoclonal antibody on the grounds of the preservation number is NO.C201654 CCTCC secreted by hybridoma cell strain Jnw1D2. It can be used for the simultaneous detection of aflatoxin and carbaryl content in the sample, has the characteristics of simple operation, rapid and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及应用
本专利技术具体涉及一种同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及其应用。
技术介绍
黄曲霉毒素是一类主要的真菌毒素污染物，毒性强、污染广，被世界卫生组织划分为一类致癌物。其毒性表现在对动物致癌、致突变、致畸，可引起DNA损伤和免疫抑制。黄曲霉毒素污染可发生在种植、收获和贮藏、运输、消费等各环节，污染的产品多以谷物、坚果为主，在其他产品如肉、蛋、奶中也均有检出。甲萘威是一种被广泛用于蔬菜、水果、谷物等农作物的一类氨基甲酸酯类农药，对害虫具有较好的防治效果，然而由于其在农业生产上的滥用和违禁使用，使其对人们的饮食安全造成重大威胁，我国规定甲萘威在谷物中限量0.5-1μg/mL，蔬菜中限量为1μg/mL。黄曲霉毒素与甲萘威在谷物中往往会造成同时污染，需要研制一种方便快捷的检测技术对两类污染物进行同时检测。目前，黄曲霉毒素与甲萘威的检测方法主要有液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法等。这些方法稳定性好、灵敏度高、准确性好，但是前处理步骤复杂，样品检测成本高。免疫层析法克服了上述不足，其以抗原抗体特异性反应为基础，用硝酸纤维素将抗原固定，使层析过程中游离靶标物与检测线上的抗原竞争结合已标记抗体，通过结合在检测线上标记物的量计算样品中靶标物的含量。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种能同步检测黄曲霉毒素、甲萘威混合污染的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及其应用。该时间分辨荧光免疫层析试剂盒可用于样品中黄曲霉毒素、甲萘威含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：同步检测黄曲霉毒素、甲萘威混合污染的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线位于质控线下方，个数为2条，检测线上分别上包被黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物和甲萘威-卵清白蛋白偶联物；所述的抗甲萘威单克隆抗体为由保藏编号为CCTCCNO.C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生的。该杂交瘤细胞株已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:C201654。按上述方案，所述铕标记的抗甲萘威单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将甲萘威单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中振摇反应2h以上，离心去上清，封闭得到目标产物；所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将黄曲霉毒素单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中振摇反应2h以上，离心去上清，封闭得到目标产物按上述方案，所述的活化方法为取铕标记试剂，用硼酸缓冲液中超声分散，然后加缓慢加入碳二亚胺溶液，振荡活化，离心去上清液，用硼酸缓冲液复溶，备用。所述的活化时间为15-30min。按上述方案，所述的封闭液为含0.5-1％BSA的硼酸缓冲液。按上述方案，所述铕标记试剂以有效量计与黄曲霉毒素单克隆抗体的质量比为1:(0.001-0.1)，铕标记试剂以有效量计与甲萘威抗体的质量比为1:(0.001-0.1)。按上述方案，所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品是将铕标记的单克隆抗体加入抗体保护液中冻干的；所述铕标记的抗甲萘威单克隆抗体冻干品是将铕标记的抗甲萘威单克隆抗体加入抗体保护液中冻干的；所述的抗体保护液为0.01％-0.30vt％(体积分数)的吐温-20、0.5-1.5wt％蔗糖和0.1-1wt％牛血清蛋白(BSA)水溶液；按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长15-35mm，宽3-5mm；样品垫长12-18mm，宽2-5mm，相邻各垫的交叠长度为1-3mm；所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为6-15mm，每相邻两条检测线之间的间距为1.5-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线的间距为4-10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg，每厘米检测线所需的甲萘威-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.8-1.0μg；所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的抗甲萘威单克隆抗体冻干品的含量为0.2-0.4μg；按上述方案，所述的时间分辨荧光试纸条的制备方法如下：(1)将吸水纸剪裁为吸水垫；(2)检测垫的制备：将黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物、甲萘威-卵清白蛋白偶联物配制成浓度为0.25-2mg/mL的包被液，用划膜方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，得到2条检测线，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1-0.45mg/mL的包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.4～0.8μg，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；(3)样品垫的制备：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥4-10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；(4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，即得免疫层析时间分辨荧光试纸条；按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物包被液、甲萘威-卵清白蛋白偶联物包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有卵清白蛋白0.5-2g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；上述免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒在黄曲霉毒素、甲萘威含量检测中的应用：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入时间分辨荧光试纸条，37℃反应6分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)荧光强度与质控线(C)荧光强度的比值；基于预先获得的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素、甲萘威浓度的关系曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】
同步检测黄曲霉毒素、甲萘威混合污染的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线位于质控线下方，个数为2条，检测线上分别上包被黄曲霉毒素‑牛血清白蛋白偶联物和甲萘威‑卵清白蛋白偶联物；所述的抗甲萘威单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生的。

【技术特征摘要】
1.同步检测黄曲霉毒素、甲萘威混合污染的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线位于质控线下方，个数为2条，检测线上分别上包被黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物和甲萘威-卵清白蛋白偶联物；所述的抗甲萘威单克隆抗体为由保藏编号为CCTCCNO.C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生的。2.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述铕标记的抗甲萘威单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将甲萘威单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中振摇反应2h以上，离心去上清，封闭得到目标产物；所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将黄曲霉毒素单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中振摇反应2h以上，离心去上清，封闭得到目标产物。3.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述的活化方法为取铕标记试剂，用硼酸缓冲液中超声分散，然后加缓慢加入碳二亚胺溶液，振荡活化，离心去上清液，用硼酸缓冲液复溶，备用；所述的活化时间为15-30min；所述的封闭液为含0.5-1％BSA的硼酸缓冲液。4.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述铕标记试剂以有效量计与黄曲霉毒素单克隆抗体的质量比为1:(0.001-0.1)，铕标记试剂以有效量计与甲萘威抗体的质量比为1:(0.001-0.1)。5.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品是将铕标记的单克隆抗体加入抗体保护液中冻干的；所述铕标记的抗甲萘威单克隆抗体冻干品是将铕标记的抗甲萘威单克隆抗体加入抗体保护液中冻干的；所述的抗体保护液为0.01％-0.30vt％(体积分数)的吐温-20、0.5-1.5wt％蔗糖和0.1-1wt％牛血清蛋白(BSA)水溶液。6.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长15-35mm，宽3-5mm；样品垫长12-18mm，宽2-5mm，相邻各垫的交叠长度为1-3mm；所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为6-15mm，每相邻两条检测线之间的间距为1.5-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线的间距为4-10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。7.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg，每厘米检测线所需的甲萘威-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.8-1.0μg；所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的抗甲萘威单克隆抗体冻干品的含量为0.2-0.4μg。8.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，唐晓倩，张奇，张兆威，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42