同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，属于黄曲霉毒素含量的超高效液相色谱检测领域。本发明专利技术同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，包括以下步骤：(1)提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中的黄曲霉毒素B1和M1，得到提取液；(2)将提取液进行净化、衍生；(3)采用超高效液相色谱法进行定性定量测定。本发明专利技术方法使肉鸡肝脏、肾脏或鸡肉中的黄曲霉毒素B1和M1得到充分提取分离，具有准确度好、重现性稳定、灵敏度高、快速等优点，能够应用于检测动物可食用组织中的黄曲霉毒素残留。

Simultaneous determination of aflatoxin B1 and M1 in broiler liver, kidney and chicken by ultra high performance liquid chromatography

The invention discloses an ultra high performance liquid chromatography method for simultaneously detecting aflatoxin B1 and M1 content in chicken liver, kidney and chicken, which belongs to the field of ultra high performance liquid chromatography detection of aflatoxin content. Simultaneous detection of liver and kidney in chicken broiler and aflatoxin B1 and M1 content of the ultra high performance liquid chromatography method of the invention comprises the following steps: (1) extraction to be detected in the liver and kidney in chicken or chicken tissues of aflatoxin B1 and M1, get the extract; (2) to extract purification and derivatization; (3) the qualitative and quantitative determination by ultra performance liquid chromatography. The method of the invention can make chicken liver and kidney or chicken in aflatoxin B1 and M1 can be fully extracted, with good accuracy and reproducibility, stability, high sensitivity, fast, can be applied to the detection of aflatoxin residues in edible animal tissue.

【技术实现步骤摘要】
同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法
本专利技术涉及肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉组织中黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素M1含量的检测方法，尤其涉及同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉组织中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，属于黄曲霉毒素含量的超高效液相色谱检测领域。
技术介绍
黄曲霉毒素(Aflatoxins，简称AFT)，是由真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一组强毒性的次生代谢产物，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，尤其是黄曲霉毒素B1为强污染物质，其分布范围广，主要产生和存在于发霉变质的粮食谷物或其生产制品中。动物食用了含有黄曲霉毒素B1(AFB1)的饲料后，在体内经羟基化代谢会产生黄曲霉毒素M1(AFM1)，二者均具有极强的毒性，能引起人类特别是儿童、各种饲养动物的中毒，还能致癌、致畸、致突变，即使每千克物质中含有几十微克的量仍有很大的毒性，二者均会残留于动物的肝、肾、肌肉等人类可食用部分，对人类、家禽、家畜的健康造成了极大的威胁。超高效液相色谱方法(UPLC)是分离科学中的一个全新类别，它借助高效液相色谱法(HPLC)的理论和原理，涵盖了小颗粒填料，非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量，灵敏度和色谱峰容量。与传统的HPLC相比，UPLC的灵敏度及分离度均提高了数倍甚至数十倍，且缩短了分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本，是一种比HPLC更快速、更高效、更灵敏的残留检测方法。因此，建立一种准确、灵敏、高效的超高效液相色谱法检测肉鸡可食用组织中的黄曲霉毒素残留，对保证畜禽产品的安全和维护人类的健康均具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1(AFB1)和黄曲霉毒素M1(AFM1)含量的超高效液相色谱方法，该方法使AFB1和AFM1得到充分的提取分离，具有准确度好、重现性稳定、灵敏度高等优点。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中AFB1和AFM1含量的超高效液相色谱方法，包括以下步骤：(1)提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织中的AFB1和AFM1，得到提取液；(2)将提取液进行净化、衍生；(3)采用超高效液相色谱进行定性定量测定。步骤(1)所述提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织中的AFB1和AFM1包括：将待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织粉碎，加入提取溶剂，经超声处理后，摇床震荡，然后加入无水硫酸钠，离心，取上清。其中，所述提取溶剂选自二氯甲烷、70％-100％甲醇溶液或84％乙腈溶液(体积百分比)中的任意一种，优选为二氯甲烷；进一步优选的，按照g/ml计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织：提取溶剂＝1：10。所述超声的时间为10min；超声的功率为60Hz；所述摇床震荡的时间为30-90min，优选为60min；所述摇床震荡的转速为400r/min。按照质量比计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织：无水硫酸钠＝1：1。步骤(2)所述净化包括：将提取液通过黄曲霉毒素免疫亲和柱，收集洗脱液；其中所述黄曲霉毒素免疫亲和柱选自AFM1免疫亲和柱或AFB1免疫亲和柱中的任意一种，优选为AFM1免疫亲和柱。具体的净化步骤包括：取提取液10ml，50℃水浴条件下氮气吹干，加入2ml甲醇溶解残渣，加入pH7.4PBS溶液13mL，通过AFM1免疫亲和柱，流速1-2滴/秒，10ml纯水冲洗免疫亲和柱，压入空气排出柱内残余水分，加入1ml甲醇洗脱，收集全部洗脱液。步骤(2)所述衍生的方法为三氟乙酸柱前衍生法(参见文献“高效液相色谱法对肉鸡组织样品中黄曲霉毒素B1残留量的测定”，《黑龙江畜牧兽医》科技版，2015年10月(上)281-287.)；衍生后的产物经氮气吹干、定容，用于上样。具体的包括：将洗脱液经氮气吹干，加入三氟乙酸、正己烷，水浴衍生，然后氮气吹干，定容；进一步具体的，收集用1ml甲醇洗脱的全部洗脱液，50℃水浴条件下氮气吹干，加入100μl三氟乙酸、200μl正己烷，40℃水浴衍生15min，50℃水浴条件下氮气吹干。所述定容用的溶液为10％-100％甲醇水溶液或10％-100％乙腈溶液，优选为10％甲醇水溶液(体积百分比)。步骤(3)所述超高效液相色谱的条件包括：色谱柱为WatersAcquityUPLCBEHC18，规格为50mm×2.1mm×1.7μm；流速0.1-0.3mL/min；进样量为10μL；流动相为乙腈：水；柱温20-30℃；激发波长365nm，发射波长435nm；运行时间4min。按照体积比计，所述流动相为乙腈：水＝15-30：70-85，即乙腈和水的比例为15：85、20：80、25：75或30：70；优选的，所述流动相为乙腈：水＝20：80；所述柱温优选为25℃；所述流速优选为0.2mL/min。步骤(3)定性定量测定包括：根据待检测黄曲霉毒素与黄曲霉毒素标准品的保留时间一致，确定为目标黄曲霉毒素。根据黄曲霉毒素标准品浓度与色谱峰面积做线性回归，得到线性回归方程；将待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中黄曲霉毒素的峰面积带入相应的线性回归方程，计算目标黄曲霉毒素的相应浓度。提取用有机溶剂对于肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中的AFB1和AFM1的充分提取分离具有重要影响。根据黄曲霉毒素的性质，一般提取用有机溶剂主要有甲醇、二氯甲烷和乙腈。本专利技术对三种有机溶剂对黄曲霉毒素的提取效果进行了比较，其中80％甲醇与84％乙腈为提取饲料中黄曲霉毒素的常用溶剂，但用于提取肝脏、肾脏或肌肉等组织中黄曲霉毒素的回收率显著低于二氯甲烷。而且，二氯甲烷为提取溶剂时AFB1和AFM1的加标回收率显著高于不同浓度的甲醇溶液。因此，本专利技术选择二氯甲烷为组织中AFB1和AFM1的提取溶剂。震荡提取时间对加标回收率也存在显著影响。在30-90min范围内，当震荡提取时间为60min时，AFB1和AFM1的加标回收率均极显著高于震荡提取30-50min；继续延长震荡时间至70-90min，AFB1和AFM1的加标回收率与震荡60min差异不显著。因此，本专利技术优选震荡提取时间为60min。本专利技术对净化提取液用的免疫亲和柱进行了考察。黄曲霉毒素M1的免疫亲和柱对AFM1和AFB1的回收率均很高，而AFB1免疫亲和柱不能吸附AFM1。因此本专利技术选择AFM1免疫亲和柱。定容用溶液的优化结果表明，有机相选择甲醇且比例在10％时，色谱峰峰型好，溶剂峰对AFM1峰型干扰小，峰面积大。本专利技术对色谱条件包括流动相、流速、柱温以及检测波长进行了优化。流动相优化结果表明，流动相乙腈：水为20：80条件下AFB1和AFM1峰面积显著大于其它比例流动相。流速优化结果表明，流速为0.2ml/min时AFB1和AFM1峰面积显著大于流速为0.1或0.3ml/min(P<0.01)，且峰型好，色谱峰能得到较好的分离；而流速为0.1ml/min时出峰时间晚，且峰型低平；流速为0.3ml/min时，出峰时间过早，与溶剂峰分离不彻底。柱温优化结果表明，在柱温为25℃时分离效果好，峰型好，峰面积大，与其他处理比较差异显著(P<0.01)。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中的黄曲霉毒素B1和M1，得到提取液；(2)将提取液进行净化、衍生；(3)采用超高效液相色谱进行定性定量测定。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中的黄曲霉毒素B1和M1，得到提取液；(2)将提取液进行净化、衍生；(3)采用超高效液相色谱进行定性定量测定。2.按照权利要求1所述的超高效液相色谱方法，其特征在于，步骤(1)所述提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中的黄曲霉毒素B1和M1包括：将待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织粉碎，加入提取溶剂，经超声处理后，摇床震荡，然后加入无水硫酸钠，离心，取上清。3.按照权利要求2所述的超高效液相色谱方法，其特征在于，所述提取溶剂选自二氯甲烷、70％-100％甲醇溶液或84％乙腈溶液中的任意一种，优选为二氯甲烷；更优选的，按照g/ml计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织：提取溶剂＝1：10。4.按照权利要求2所述的超高效液相色谱方法，其特征在于，所述超声的时间为10min；超声的功率为60Hz；所述摇床震荡的时间为30-90min，优选为60min；所述摇床震荡的转速为400r/min。5.按照权利要求2所述的超高效液相色谱方法，其特征在于，按照质量比计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织：无水硫酸钠＝1：1。6.按照权利要求1所述的超高效液相色谱方法，其特征在于，步骤(2)所述净化包括：将提取液通过黄曲霉毒素免疫亲和柱，收集洗脱液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秀英，金慧然，崔晓旭，李蕊，郭文欣，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23