一种用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法。该方法为：将待测样品与所述荧光标记物溶液以及甲萘威单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值，根据荧光偏振值‑甲萘威标准样品中甲萘威浓度标准曲线，计算所述待测样品中甲萘威的浓度。本发明专利技术提供的甲萘威荧光偏振免疫检测方法(Fluorescence Polarization Immunoassay,FPIA)方法只需要加样，无需分离和洗涤操作，十分钟内就可获得检测结果。能够满足甲萘威的残留检测限量要求。

An analysis method for fluorescence polarization immunoassay of carbaryl

The invention relates to a method for analysis of fluorescence polarization immunoassay of carbaryl. The method is that the sample to be measured with the fluorescent marker solution and carbaryl monoclonal antibody solution, incubation of competition reaction, the fluorescence polarization measured value in the system, according to the fluorescence polarization value standard of carbaryl concentration curve carbaryl in standard samples, calculate the concentration of the sample to be measured in carbaryl. Carbaryl fluorescence polarization immunoassay method provided by the invention (Fluorescence Polarization Immunoassay, FPIA) method only needs the sample, without separation and washing operation, can obtain test results within ten minutes. To meet the requirements of the detection limits of carbaryl residues.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法
本专利技术属于免疫分析技术和农药残留检测领域，具体涉及一种用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法。
技术介绍
甲萘威又称西维因、安甲萘，属氨基甲酸酯类杀虫剂，具有高效、持续期长、选择高等特点，是国内使用量较大的广谱性农药，广泛应用于水果、蔬菜、棉花和茶叶等作物生产中。甲萘威是中等毒性农药，具有触杀及胃毒作用，在水体、土壤、水果、粮食等介质中残留时间长，极易引起农产品中残留超标和安全消费问题，对人的免疫系统、神经中枢和内分泌系统造成损害，威胁农业产业可持续发展。2008年欧盟化学品审查委员会第四次会议中的附件Ⅱ明确提出了禁止甲萘威的使用，认为甲萘威除了吞食和内吸性毒性以外，能引发人体所有脏器肿瘤(其中以消化道癌最为常见)，属于第三类致癌物质。GB2763-2014食品安全国家标准食品中农药残留最大限量中明确规定了甲萘威在蔬菜中的最大残留限量(MaximumResidueLimit,MRL)为1ppm，谷物中为0.5-1ppm，茶叶中为1ppm。标准中没有规定甲萘威在水果中的最大残留限量，参考各国对其规定，甲萘威在水果中的MRL为1-5ppm。目前，甲萘威残留的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、胆碱酯酶抑制法和免疫分析法。其中高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱-质谱联用法虽然准确度高、重现性好，但是需要依赖于昂贵的仪器设备，分析成本高且对检测环境和操作人员均有较高要求，难以满足现场快速检测需求；胆碱酯酶抑制法具有通用性强、简便快速等优点，一定程度上满足了现场检测需求，但其灵敏度低，难以满足痕量检测需求。免疫分析技术，因具有灵敏度高、特异性强、成本低、简便快速等优点被越来越广泛地应用于农药残留检测领域。但是常用的酶联免疫吸附法和侧流免疫层析技术需要进行多步分离和洗涤操作，操作较复杂、耗时较长。
技术实现思路
本专利技术针对现有的甲萘威免疫检测技术中，操作复杂、耗时长等缺点，建立一种用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法，整个检测过程只需要一步竞争反应，操作简单、快速。本专利技术所提供的用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法：将待测样品与所述荧光标记物溶液以及甲萘威单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值，根据荧光偏振值-甲萘威标准样品中甲萘威浓度标准曲线，计算所述待测样品中甲萘威的浓度。按上述方案，所述的荧光偏振值-甲萘威标准样品中甲萘威的浓度标准曲线是采用以下方法获得的：将一系列已知浓度的甲萘威标准品的溶液分别与荧光标记物溶液以及甲萘威单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；以测定的荧光偏振值为纵坐标，所述一系列已知浓度的甲萘威标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线。按上述方案，所述荧光标记物为甲萘威半抗原6-(1-萘氧基甲酰胺基)-己酸(CNH)与荧光素的酰胺偶联物。按上述方案，所述荧光素选自下述任意一种：异硫氰酸荧光素乙二胺(EDF)，异硫氰酸荧光素丁二胺(BDF)，异硫氰酸荧光素己二胺(HDF)；所述荧光标记物具有表1所示的结构；表1按上述方案，所述荧光标记物优选为CNH-EDF。按上述方案，所述甲萘威单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:C201654，保藏日期：2016年3月29日。按上述方案，所述一系列已知浓度的甲萘威标准品的溶液为100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL和0.001μg/mL9个浓度梯度。按上述方案，所述的配制荧光标记物溶液的溶剂为硼酸盐缓冲溶液；所述荧光标记物的工作浓度为荧光标记物的荧光值是背景值硼酸盐缓冲溶液10倍时对应的浓度，为5nM。按上述方案，所述与荧光标记物有70％结合时对应的抗体稀释倍数作为甲萘威单克隆抗体的工作浓度，为1ug/mL。按上述方案，所述待测样品的溶液体积为50μL，所述荧光标记物溶液和所述甲萘威单克隆抗体溶液的体积分别为500μL。按上述方案，所述竞争反应的温度为20-25℃，优选为25℃，时间为5-10min，优选为10min。按上述方案，所述荧光偏振值的测定条件为：激发波长为485nm，发射波长为530nm。按上述方案，所述待测样品可为水果、蔬菜等农产品。具体可为草莓；检测前，将草莓前处理得到待测样品基质溶液，所述的前处理为：将草莓样品捣碎，加乙腈匀浆，将过滤液收集到含有氯化钠的离心管中，离心收集上清提取液，充分蒸干溶剂，加甲醇溶解样品残渣得到样品基质溶液；检测样品为草莓时，选择空白草莓样品前处理得到的样品基质溶液配置一系列已知浓度的甲萘威标准品的溶液，进行FPIA实验得到草莓基质标准曲线。上述方法在农产品中甲萘威含量检测中的应用。本专利技术的检测原理：甲萘威单克隆抗体与荧光素标记的甲萘威半抗原特异性结合，使得荧光素的荧光偏振信号值增加。而待测样品存在甲萘威时(或甲萘威标准品存在时)，甲萘威与荧光素标记的甲萘威半抗原竞争结合甲萘威单克隆抗体，使得与甲萘威单克隆抗体结合的荧光素标记的甲萘威半抗原减少，且荧光偏振信号值随着待测甲萘威浓度的增加而降低，由此本专利技术可基于高灵敏高特异性的甲萘威单克隆抗体实现对甲萘威的快速高灵敏定量检测。本专利技术的有益效果是：现有的甲萘威检测技术操作繁琐耗时，不能满足高通量快速检测的要求，而且其他免疫分析方法大多为非均相反应，需要多步孵育和洗涤步骤，耗时长，操作复杂。针对这些不足，本专利技术提供了一种均相的、快速的甲萘威荧光偏振免疫检测方法(FluorescencePolarizationImmunoassay,FPIA)方法只需要加样，无需分离和洗涤操作，十分钟内就可获得检测结果。本专利技术建立的甲萘威荧光偏振免疫分析方法在硼酸盐缓冲溶液中标准曲线的灵敏度为82.3ng/mL，检测范围为17.7-383.4ng/mL，在样品中的检测灵敏度为108.6μg/kg，检测范围为32.4-363.6μg/kg；该方法快速、简便高通量，而且能够满足甲萘威的残留检测限量要求，非常适合草莓样品中甲萘威的检测需求。附图说明图1为硼酸盐缓冲液中甲萘威荧光偏振免疫检测的标准曲线。图2为草莓样品基质中甲萘威荧光偏振免疫检测的标准曲线。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行说明，但本专利技术并不局限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法：下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特设说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的甲萘威单克隆抗体为杂交瘤细胞株Jnw1D2所分泌的单克隆抗体。具体获得方法：杂交瘤细胞株Jnw1D2的筛选1.动物免疫购买6周龄BALB/c小鼠6只，用6-(1-萘氧基甲酰胺)-己酸(CNH)偶联牛血清白蛋白(BSA)，获得甲萘威完全抗原CNH-BSA，免疫小鼠。第一次免疫将甲萘威完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积的甲萘威完全抗原乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射。第三本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：将待测样品与所述荧光标记物溶液以及甲萘威单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值，根据荧光偏振值‑甲萘威标准样品中甲萘威浓度标准曲线，计算所述待测样品中甲萘威的浓度。

【技术特征摘要】
1.用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：将待测样品与所述荧光标记物溶液以及甲萘威单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值，根据荧光偏振值-甲萘威标准样品中甲萘威浓度标准曲线，计算所述待测样品中甲萘威的浓度。2.根据权利要求1所述的用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：所述的荧光偏振值-甲萘威标准样品中甲萘威的浓度标准曲线是采用以下方法获得的：将一系列已知浓度的甲萘威标准品的溶液分别与荧光标记物溶液以及甲萘威单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；以测定的荧光偏振值为纵坐标，所述一系列已知浓度的甲萘威标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线。3.根据权利要求1所述的用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：所述荧光标记物为甲萘威半抗原6-(1-萘氧基甲酰胺基)-己酸与荧光素的酰胺偶联物。4.根据权利要求1所述的用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：所述荧光素选自下述任意一种：异硫氰酸荧光素乙二胺，异硫氰酸荧光素丁二胺，异硫氰酸荧光素己二胺；所述荧光标记物具有下表所示的结构；5.根据权利要求1所述的用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：所述甲萘威单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，李慧，杨青青，唐晓倩，张奇，张文，张兆威，丁小霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42