基于荧光偏振的黄曲霉素均相检测法及其试剂盒制造技术

一种用于测定农产品中黄曲霉素的均相检测法，该方法使用荧光偏振技术。使用一种溶剂从农产品样品中提取黄曲霉素。通过将提取物、示踪剂和黄曲霉素特异性单克隆抗体相混合得到一混合物。示踪剂能够与单克隆抗体结合以产生能够检测的荧光偏振变化。示踪剂通过适合的荧光团与黄曲霉素肟共轭得到。测量混合物的荧光偏振。通过测量一系列已知浓度的黄曲霉素溶液的荧光偏振得到标准曲线，利用该标准曲线计算混合物中黄曲霉素的浓度。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术本景1.专利
本专利技术涉及霉菌毒素的检测领域。尤其涉及一种均相检测法，其通过改变荧光偏振以监测农产品中存在的黄曲霉素。2.相关文献描述黄曲霉素是由Aspergillus flavus方式生成的霉菌毒素1。黄曲霉素已经被发现很长时间了，但是其致癌作用在19世纪60年代后期才被首次发现。不同类型的黄曲霉素，包括B1，B2，G1，和G2以及许多其它类型存在于多种人类食品中，诸如谷类食品、谷粒和花生制品9，11。黄曲霉素B1是所有类型中毒性最大、存在最广泛的一种。接触黄曲霉素会提高原发性肝细胞癌症的发生率7。由于黄曲霉素的毒性和致癌性，人们已经设计出多种定量测定农产品中黄曲霉素含量的分析方法1-4，6，8。这些检测方法的一个难题是黄曲霉素的强疏水性，其在水溶剂中溶解度很差。因此，通常采用含水的有机溶剂混合物提取样品中的黄曲霉素。另一个难题是大多数常用检测方法，包括TLC和HPLC10，在提取之后需要进一步的清除步骤和衍生化以除去干扰物质。ELISA方法检测得相对快，但由于需要多种清洗步骤、液相转移和培养时间以及清除步骤因而难于定量。因此，需要获得一种快速测定农产品中的黄曲霉素、便于操作且可以定量分析的检测方法。专利技术概述本专利技术的首要方案在于提供一种测定农产品中黄曲霉素的均相检测法。从样品中提取黄曲霉素，将提取物与示踪剂和抗体混合得到一混合物。抗体是黄曲霉素的特异性抗体。示踪剂包括与荧光团共轭的黄曲霉素肟。示踪剂能够与抗体结合而产生可探测到的荧光偏振变化。测量混合物的荧光偏振并与标准曲线相比较。本专利技术的第二个主要方案在于提供一种测定农产品中黄曲霉素的检测试剂盒。该检测试剂盒包括一种抗体和一种示踪剂，每个含量至少适于一次测试，并适于包装。抗体是黄曲霉素的特异性抗体。示踪剂包括与荧光团共轭的黄曲霉素肟。示踪剂能够与抗体结合而产生可探测到的荧光偏振变化。附图简要说明附图说明图1为一系列浓度的黄曲霉素在一定时间内的荧光偏振变化的曲线图，其与本专利技术的一个实施方案相一致。图2为不含黄曲霉素的样品的一系列浓度的甲醇溶液在一定时间内的荧光偏振变化的曲线图，其利用表1数据所绘制，与本专利技术的一个实施方案相一致。图3为黄曲霉素荧光偏振检测的标准曲线，其利用表2数据绘制，与本专利技术的一个实施方案相一致。图4为HPLC测得的样品的黄曲霉素浓度相对于从图3标准曲线所计算的黄曲霉素浓度的曲线图，其与本专利技术的一个实施方案相一致。图5为标定的(spiked)黄曲霉素样品浓度相对于荧光偏振测定值所计算的黄曲霉素浓度的曲线图，其与本专利技术的一个实施方案相一致。图6为荧光偏振检测黄曲霉素的标准曲线，采用该曲线获得表6和7的数据，其与本专利技术的一个实施方案一致。优选的实施方案描述本专利技术的优选实施方案提供了一种测定农产品中黄曲霉素的比较简单的均相检测方法，该方法以荧光偏振的测量为基础。荧光偏振技术已成功地用于多种物质的检测中，其中包括蛋白质、酶、药物、DNA、激素、肽和抗体。荧光偏振技术的原理如下具有较低分子量的荧光探针由于其快速旋转而具有较小偏振度，而具有较大分子量的荧光探针由于其慢速旋转而具有较大偏振度。因此，当与较大分子结合时，荧光团的偏振度增大。关于荧光偏振技术的进一步信息在美国专利号5,427,960和5,976,820以及Nasir，M.S.和Jolley，M.E.，″Fluorescence PolarizationAn analytical tool for hnmunoassay and DrugDiscovery，″Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening，1999，2，177-190中有记载，这些文献在此作为参考而引用。本专利技术中，从样品中提取到的黄曲霉素在单克隆抗体存在下与荧光示踪剂相竞争，由此而引起荧光偏振度的变化，该变化随黄曲霉素浓度的改变而改变。本专利技术的优选实施方案提供了一种黄曲霉素的均相检测法，该方法灵敏、快速、简单且成本低。该方法也可以进行便携式现场操作(field-portable)且可得到定量结果。1.材料和方法该研究使用了两种不同的黄曲霉素单克隆抗体。购自Sigma(catalog no.A-9555)的一种黄曲霉素单克隆抗体用于起初测试的开发性工作中，但发现其对甲醇敏感。在后期工作中，从美国农业部(Peoria，Illinois)农业研究所的Dr.Chris Maragos得到的一种单克隆抗体，由于其在甲醇中稳定而被采用。这种单克隆抗体的应用在Chris M.Maragos和Vicki S.Thompson，″Fiber-opticImmunosensor for Mycotoxins，″Natural Toxins 7371-376(1999)中已有报导，将此文献作为参考而引用。此外，还有很多其它的黄曲霉素单克隆抗体，参见，如美国专利号为4,835,100的专利。被黄曲霉素天然污染的玉米样品和没有被黄曲霉素污染的爆米花(popcorn)都购自Trilogy Analytical Laboratory，Inc.(Washington，Missouri)。Trilogy还提供了黄曲霉素B1/B2/G1/G2(7/1/3/1)混合物。纯的黄曲霉素B1购自Sigma。荧光偏振测定在室温下进行，采用单管Sentry-FP荧光偏振仪(DiachemixCorp.)测定。2.黄曲霉素示踪剂的制备在装有磁搅拌器和冷凝器的10ml圆底烧瓶中，加入与1.2ml绝对乙醇(absolute ethanol)混合的黄曲霉素B1(5mg，0.016mmol，Sigma)和O-羧甲基-羟基氨基半盐酸(41mg，0.19mmol，Sigma)。一边搅拌一边向该溶液中加入230μl的2MNaOH溶液(0.46mmol)，然后使溶液回流3个小时。所得溶液再在室温下搅拌过夜，用旋转蒸发仪浓缩后，用水稀释至1.5ml。逐滴加入1N NaOH，调节PH至9左右，用乙酸乙酯洗涤溶液(洗涤两次，每次约3ml)。用6M HCl酸化水层至pH约为2左右，所得混合物在冰箱中于0℃下储存。分离固体沉积物并干燥。用硅胶TLC，展开相为乙酸乙酯∶甲醇∶氨水(32∶17∶5)，显示肟产物的主斑点，其Rf值约为0.5。将上述制备的(黄曲霉素B1)-O-羧甲基肟的20μl THF溶液与20μl二环己基碳二亚胺(DCC)的二氯甲烷溶液(10mg/ml)混合于200μl的二氯甲烷中。2-3分钟后，加入20μl荧光素胺(fluoresceinamine)的THF溶液(异构体2，10mg/ml)。在室温下，使反应过夜。在黄曲霉素肟不存在的情况下，进行同样的反应作为对照反应。产物的TLC(利用CHCl3∶MeOH∶CH3CO2H，40∶10∶3展开)显示了多个斑点。对照反应中缺少Rf～0.7的斑点。收集示踪剂，并溶于甲醇中，然后用缓冲液稀释10μl的示踪剂溶液至1ml，其相对荧光强度为～400,000单元(unit)。观察到该示踪剂可以提供～40mP的稳定偏振。加入10μl的1/50稀释的抗体(Sigma，A-9555)得到最终的稀释液1/5,000，在5分钟内其偏振度慢速增加至～230mP。为了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测定农产品中黄曲霉素的均相检测法，所述均相检测法包括下列步骤：　　　　从样品中提取黄曲霉素，得到提取物；　　　　将所述提取物与示踪剂和抗体混合，得到一混合物，所述抗体为黄曲霉素特异性抗体，所述示踪剂包括与荧光团共轭的黄曲霉素肟，所述示踪剂能够与所述抗体结合以产生能够检测的荧光偏振变化；　　　　测量所述混合物的荧光偏振以获得荧光偏振测量值；以及　　　　将荧光偏振测量值与特征性荧光偏振数值相比较，所述特征性荧光偏振数值与已知黄曲霉素浓度相对应。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：穆罕默德萨瓦尔纳西尔，迈克尔E乔利，
申请(专利权)人：迪亚科密克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]