雪松疫霉的分子检测方法及其引物技术

本发明专利技术公开了一种雪松疫霉的分子检测方法及其引物，建立了一套快速、高灵敏度、稳定可靠的检测雪松疫霉的分子检测技术。本发明专利技术方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，可参考应用于出入境植物和植物产品的检验检疫和田间调查，对控制雪松疫霉传入我国具有重要意义，同时，本发明专利技术体系的建立也为其它病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测雪松疫霉的引物，以及利用所述引物检测雪松疫霉的分子检测方法。
技术介绍
雪松疫霉根腐病菌、Phytophthora lateralis Tucker et Mibrath)引起雪松根部腐烂病。该病害1920年在美国华盛顿西雅图里首次发现。目前该病菌广泛分布于世界各地(Smith I Μ. Phytophthora lateralisEPPO Bulletin, 2009. 39(1) 43-47. )0 该病害于2010年在我国台湾省首次报道(Brasier C M, Vettraino A M, Chang T T, et al. Phytophthora lateralis discovered in an old growth Chamaecyparis forest in Taiwan [J], Plant Pathology, 2010， 59(4): 595-603)，大陆地区尚未发现，是一类危险性植物检疫性病害。雪松疫霉根腐病菌不仅危害雪松，还可以侵染美国扁柏、短叶红豆杉、美国尖叶扁柏、猕猴桃、扁柏、杜松、侧柏、杜鹃花属植物(James W, Claire S. Pest Risk Analysis For Phytophthora lateralis [Z].2006.)。该病害诊断困难，按常规方法分离会产生很多杂菌，影响病原菌的准确分离。 同时，疫霉形态特征复杂，变异快，且A hterahi与其它病原菌如A cinnamomi、P. gonapodyides %%\iX/rf ^(Torgeson D C, Young R A, Milbrath J A. Phytophthora root rot diseases of Lawson cypress and other ornamentals[M]. Agricultural Experiment Station, Oregon State College, 1954)。因此，常规的病害诊断技术难以快速准确鉴定该病原菌。随着分子生物学技术的发展，国内外对很多疫霉的分子检测进行了不少研究。现已证明，由于tRNA序列在真菌(卵菌)种间高度变异、而在种内稳定，因此该序列为病原菌的分子检测提供了理想的靶序列。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种雪松疫霉的分子检测方法及其引物，利用该引物及检测方法检测雪松疫霉，速度快、准确、灵敏度高、稳定可靠。本专利技术提供的技术方案是一种用于检测雪松疫霉的引物，其上游引物序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。一种检测雪松疫霉的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物。一种利用上述引物检测雪松疫霉的方法，其过程是提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为 192bp的DNA条带，则证明所检样品中含有雪松疫霉。上述的检测雪松疫霉的方法，进一步地，所述PCR反应的扩增体系为10.0 μ L SYBR Premix Ex TaqTM(2Χ) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II(50X)，引物(10 μ mol/L) 各0.4 yL，模板2 μ L，用灭菌水补足体积至20 μ L0所述的检测雪松疫霉的方法，所述PCR反应的反应程序为94° C预变性30 s ；94° C 变性 5 s, 46° C 退火 34 s，40 个循环；95° C 15 s，60° C 1 min, 95° C 15 s, 60° C 15 s。进一步地，为提高检测雪松疫霉的灵敏度，本专利技术还提供另一种用于检测雪松疫霉的引物，包括两对引物，即第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所述。本专利技术还提供另一种检测雪松疫霉的试剂盒，其包含上述的第一对引物和和第二对引物。本专利技术还提供另一种检测雪松疫霉的方法，其过程是提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的 DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为192bp的 DNA条带，则证明所检样品中含有雪松疫霉。本专利技术具有以下有益效果本文通过设计一对特异性引物T1/T2 (核苷酸序列如SEQ ID No. 1/SEQ ID No. 2)，结合PCR扩增的方法可以有效地检测植物组织中的A lateralis。本专利技术方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，可参考应用于出入境植物和植物产品的检验检疫和田间调查，对控制雪松疫霉传入我国具有重要意义，同时，本专利技术体系的建立也为其它病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。本专利技术对从GenBank中得到A lateralis和其它疫霉种的tRNA序列进行分析， 设计了一对特异性引物T1/T2 (核苷酸序列如SEQ ID No. 1/SEQ ID No. 2)，利用该引物对其它15种疫霉和其它真菌进行特异性扩增，发现只能从A lateralis中扩增得到一条 192 bp的条带，其它菌株均无扩增条带出现，表明该对引物具有种的特异性。以真菌的 rDNA-ITS序列设计特异性引物来进行病害的诊断和植物病原真菌的分子检测，得到广泛应用，曾有学者利用rDNA-ITS序列的差异设计了 A lateralis的特异性引物(Winton L Μ, Hansen E Μ. Molecular diagnosis of Phytophthora lateralis in trees, water, and foliage baits using multiplex polymerase chain reaction[J]. Forest Pathology, 2001，31 (5) : 275-283)，但是A lateralis与P.應的ITS序列高度相似，无法将两者区分(Martin F N，Tooley P W. Phylogenetic relationships of Phytophthora ramorum, P. nemorosa, and P. pseudosyringae, three species recovered from areas in California with sudden oak death[J]. Mycological Research, 2003， 107(12): 1379-1391)。而本专利技术使用这对引物则可较容易将二者区分开来。高灵敏度是病原菌检测的一个重要指标，它关系到能否把PCR快速检测技术直接应用在出入境植物和植物产品的检验检疫中。在25 μ L反应体系中，普通的PCR方法能检测到10 pg P. lateralis基因组DNA。曾经报道套式PCR能把检测灵敏度提高l(Tl 000倍 (本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测雪松疫霉的引物，其特征在于其上游引物序列如SEQ ID No. 1所述， 下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。2.一种检测雪松疫霉的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求1所述的引物。3.一种雪松疫霉的分子检测方法，其特征在于提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为 192 bp的DNA条带，则证明所检样品中含有雪松疫霉。4.根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于所述PCR反应的扩增体系为 10. 0 μ L SYBR Premix Ex TaqTM(2Χ) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II(50X)，引物(10 μ mol/L)各0. 4 μ L，模板2 μ L，用灭菌水补足体积至20 μ L。5.根据权利要求4所述的分子检测方法，其特征在于所述PCR反应的反应程序为 94° C 预变性 30 s ；94° C 变性 5 s，...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪睿，张正光，廖太林，李百胜，王健生，
申请(专利权)人：中华人民共和国昆山出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：