一种快速检测玉米赤霉烯酮的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括如下步骤：（A）使玉米赤霉烯酮核酸适体（Apt）和可与玉米赤霉烯酮核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品接触，当待测样品中有玉米赤霉烯酮存在时，杂交链与玉米赤霉烯酮反应释放出单链信号探针ssDNA；（C）利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用核酸外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA不水解而保留下来；（D）在铜离子还原检测体系中检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。所述方法可以消除干扰，提高了玉米赤霉烯酮的检测灵敏度和精度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属纳米生物传感以及生物检测
，涉及玉米赤霉烯酮的检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
玉米赤霉烯酮主要由禾谷镰刀菌产生，粉红镰刀菌、窜珠镰刀菌、三线镰刀菌等多种镰刀菌也能产生这种毒素。李季伦1980年研究发现，许多农作物如小麦、大豆等植物中也存在玉米赤霉烯酮。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的玉米赤霉烯酮阳性检出率为45%，最高含毒量可达到2909mg/kg；小麦的检出率为20%，含毒量为0.364～11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110℃下处理1h才被完全破坏。玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，能造成动物急慢性中毒，引起动物繁殖机能异常甚至死亡，可给畜牧场造成巨大经济损失。因此对玉米赤霉烯酮检测显得十分必要。现有分析方法有色谱、免疫法，前者灵敏度不够，后者存在试剂贵、易失活等缺点。中国专利CN102443585A公开了一种玉米赤霉烯酮核酸适体及其应用，其可用于玉米赤霉烯酮的检测，但存在生物标记的DNA价格昂贵的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种快速检测玉米赤霉烯酮的方法。本专利技术采用的技术方案：一种快速检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括如下步骤：（A）使玉米赤霉烯酮核酸适体（Apt）和可与玉米赤霉烯酮核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有玉米赤霉烯酮存在时，杂交链选择性地与玉米赤霉烯酮反应释放出单链信号探针ssDNA；（C）为了消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA未水解而保留下来；（D）利用铜离子在玉米赤霉烯酮核酸适体-玉米赤霉烯酮结合体中不能被还原生成荧光发射峰在620nm左右的铜纳米粒子，铜离子只在单链信号探针ssDNA存在情况下被还原生成ssDNA修饰的在620nm左右（发射峰位置）有强的荧光发射的铜纳米粒子的原理，在铜离子还原检测体系中检测体系的荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。所述铜离子还原检测体系包括先后添加的铜离子和使铜离子还原成铜纳米粒子的还原剂维生素C。步骤（D）的检测例如包括依次先后向体系中加入铜离子溶液和维生素C溶液，反应后生成荧光发射峰在620nm左右的铜纳米粒子。所述玉米赤霉烯酮核酸适体为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。所述的单链信号探针ssDNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACTTCACACGATT-3’。本专利技术的检测原理如下：先让Apt与ssDNA杂交（下划线部分）；当有玉米赤霉烯酮存在时，杂交链与玉米赤霉烯酮反应释放出ssDNA；体系中存在Apt-ssDNA(剩余的)，Apt-玉米赤霉烯酮和ssDNA。铜离子在Apt-玉米赤霉烯酮中不能被还原生成荧光发射峰在620nm左右的铜纳米粒子，Apt-玉米赤霉烯酮的存在对测定无干扰；杂交链可能有干扰；为了消除杂交链的干扰：a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA未水解而保留下来；此时体系中只留下诱导铜离子还原成近红外铜纳米粒子的ssDNA，铜离子在ssDNA存在下还原并生成被ssDNA修饰的荧光发射峰在620nm左右的铜纳米粒子，以340nm的光为激发光，测定荧光发射（520nm-660nm）光谱的荧光强度，依据体系的荧光发射光谱的强度与玉米赤霉烯酮的量的关系，从而可以测定真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，可以提高检测的灵敏度和精度。本专利技术还提供了一种检测玉米赤霉烯酮的试剂盒，其至少包括：玉米赤霉烯酮核酸适体、单链信号探针DNA、DNA扩增体系、外切酶、铜离子还原检测体系。所述玉米赤霉烯酮核酸适体为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。所述可的单链信号探针DNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACTTCACACGATT-3’。所述DNA扩增体系包括缓冲溶液（缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成）、三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液（dNTP）和Phi29DNA聚合酶。所述外切酶为ExoIII核酸外切酶。本专利技术还提供了一种可用于检测玉米赤霉烯酮的玉米赤霉烯酮核酸适体，其碱基序列为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。本专利技术的优点根据本专利技术的检测方法和试剂盒，可以消除干扰，提高玉米赤霉烯酮的检测灵敏度和精度。附图说明图1为ssDNA-铜纳米粒子荧光激发与发射光谱。具体实施方式实施例1一种检测玉米赤霉烯酮的试剂盒至少包括：使玉米赤霉烯酮核酸适体、可与玉米赤霉烯酮核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、外切酶、铜离子还原检测体系。所述玉米赤霉烯酮核酸适体为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。所述的单链信号探针DNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACTTCACACGATT-3’。所述DNA包括缓冲溶液（缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成）、三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液dNTP和Phi29DNA聚合酶。所述外切酶为ExoIII核酸外切酶。所述的铜离子还原检测体系所用还原剂为维生素C。实施例2一种快速检测玉米赤霉烯酮的方法，具体操作过程如下：将各DNA储备液在95℃下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟。然后，分别取含2.5μmol玉米赤霉烯酮核酸适体Apt的杂交缓冲溶液50μL和2.5μmol信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液50μL置于2ml离心管中，在37℃下杂交1小时，生成玉米赤霉烯酮核酸适体-信本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征是，该方法包括如下步骤：（A）玉米赤霉烯酮核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有玉米赤霉烯酮存在时，杂交链选择性地与玉米赤霉烯酮反应释放出单链信号探针ssDNA；（C）为了消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用核酸外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA不水解而保留下来；（D）利用铜离子不能在玉米赤霉烯酮核酸适体‑玉米赤霉烯酮结合体中被还原生成荧光发射峰在620 nm左右的铜纳米粒子，铜离子只在单链信号探针ssDNA中还原并生成被ssDNA修饰的在620 nm左右有强的荧光发射的铜纳米粒子的原理，在铜离子还原检测体系中检测体系的荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征是，该方法包括如下步骤：
（A）玉米赤霉烯酮核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；
（B）使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有玉米赤霉烯酮存在时，杂交链选择性
地与玉米赤霉烯酮反应释放出单链信号探针ssDNA；
（C）为了消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用核酸外切酶选
择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA不水解而保留下来；
（D）利用铜离子不能在玉米赤霉烯酮核酸适体-玉米赤霉烯酮结合体中被还原生成荧
光发射峰在620nm左右的铜纳米粒子，铜离子只在单链信号探针ssDNA中还原并生成被
ssDNA修饰的在620nm左右有强的荧光发射的铜纳米粒子的原理，在铜离子还原检测体系
中检测体系的荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。
2.根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征是，所述玉米赤霉烯酮核酸
适体为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGA
AGTGC-3’。
3.根据权利要求1或2所述的检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征是，所述的单链信号探
针ssDNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACTTCACACGATT-3’。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾云龙，任婕凤，刘婷，黄昊文，张起豪，邓克勤，易守军，唐春然，
申请(专利权)人：湖南科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43