本发明专利技术公开了一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法。本发明专利技术所述方法是利用ZEN-BSA、ZEN单克隆抗体和ZEN的β型抗独特型单抗建立的竞争ELISA方法，以ZEN的β型抗独特型单抗替代ZEN标准品，从而避免了毒素对操作者的危害及向环境中散毒的可能，实现无毒检测；该方法不需使用ZEN标准品，可大大降低成本，可以大规模地对食品、谷物和饲料等污染的玉米赤霉烯酮进行快速、灵敏的检测，因此将具有良好的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及化合物检测领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法。
技术介绍
玉米赤霉烯酮(Zenralenone, ZEN)是由多种镰刀菌产生的一种类雌激素样的真菌毒素，污染范围广泛，谷实类原料在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节，都有可能受到ZEN的污染。ZEN具有较强生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对猪、家禽、反刍动物均影响较大，给畜牧业带来很大经济损失；ZEN还具有细胞毒性、免疫毒性、肝毒性、潜在致癌性等，并且ZEN对高温稳定，不易去除，严重危害人类健康。鉴于玉米赤霉烯酮对人类及其他动物具有较强的毒性作用，2000年JECFA公布了·人类对于ZEN的临时最大摄入量为40 μ g/ kg体重。截至2004年，已有27个国家或地区对ZEN在食品和饲料中的含量进行了限制，而且该数目还在继续增加之中。2006年7月I日欧盟实施的EEC 253/ 2004法规明确细分了不包含玉米的未加工谷物、谷粉、快餐和早餐食品的ZEN最大限量为100、75和50 μ g/ kg，还规定了以加工谷物为主要成分的婴幼儿食品ZEN最大限量为20 μ g/ kg。我国2006年饲料卫生标准规定玉米类饲料中ZEN最大含量为500 μ g/kg，而粮食卫生标准规定ZEN不超过60 μ g/kg。目前，免疫检测方法已成为食品安全快速检测的重要方法之一，在食品安全检测中发挥了重要作用。ZEN是一种小分子毒素，目前用于ZEN残留定量检测的免疫学方法需使用ZEN标准品，ZEN标准品的使用不仅给操作人员带来危害，同时也增加了环境中有毒有害物质的排放，因此，寻求ZEN的替代物用于ZEN的无毒检测具有重要的现实意义。β型抗独特型抗体(β-Anti- idiotype antibody, β-Aid or Ab2 β )具有与初始(半)抗原相同抗原决定簇的“内影像”作用，可以替代小分子物质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，利用ZEN的β型抗独特型单抗替代ZEN标准品，提供一种玉米赤霉烯酮竞争ELISA无毒检测方法及其应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的 本专利技术一种玉米赤霉烯酮竞争ELISA无毒检测方法，它是以检测抗原ZEN-BSA包被96孔酶标板，加入ZEN的β型抗独特型单抗(Ab20-1D5)的标准品竞争物或待测样品(疑是有ZEN污染的食品、谷物、饲料等处理试样)，再加入ZEN单克隆抗体(Abl-1G4)，检测抗原ZEN-BSA与游离的Ab2 β -1D5或游离的ZEN竞争结合ZEN单克隆抗体，洗去游离的Ab2 β -1D5与Abl-1G4- Ab2 β -1D5复合物或ZEN与Abl_lG4_ZEN复合物，与包被抗原ZEN-BSA结合的Abl-1G4再与酶标记的二抗结合，经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光度(0D)。OD值越大，样品中自由的ZEN含量越少，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中ZEN的含量。该方法的特征是具有以下检测过程和步骤 I. ZEN单克隆抗体(Abl-1G4)的制备 采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原，ZEN与BSA偶联制备检测抗原，免疫BALB/c小鼠，细胞融合，经过筛选后获得杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生法大量制备腹水型ZEN单克隆抗体；分泌ZEN单克隆抗体的杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :C201237。2. ZEN抗独特型单抗(Ab2P-lD5)的制备 ZEN单克隆抗体与KLH偶联，偶联物免疫BALB/c小鼠，经血清效价和灵敏度检测合格后，再进行偶联物腹腔注射，3天后取小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，得到杂交瘤细胞株1D5 ;通过小鼠体内诱生法大量制备腹水型ZEN抗独特型单抗；杂交瘤细胞株1D5于2012 年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :C201238。3.腹水型ZEN单克隆抗体、ZEN抗独特型单抗的纯化 腹水经饱和硫酸铵沉淀法初纯后，再用Protein G亲和层析柱进行纯化。(I)饱和硫酸铵粗纯 ①从_20°C冰箱中取6.5 mL腹水，4°C缓慢融化，12000r/min离心30min，取上清； ②在冰浴搅拌下，逐滴加入6.5 mL饱和硫酸铵溶液，4°C放置过夜； ③7500r/min离心30min,弃上清,沉淀用6. 5 mL O. IM结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 7. O)溶解，混匀； 将上述抗体溶液装入已处理过的透析袋，在层析柜中，结合缓冲液透析6h以上，每隔2h更换一次透析液。(2)上柱前的处理 抗体用20mM结合缓冲液稀释5倍，用O. 45 μ m滤膜超滤后再上Protein G柱。(3)装柱及过柱 ①装柱垂直安置柱体，接好恒流泵管，并用结合缓冲液填充柱子，进行平衡柱子，大约5-10倍柱体积，平衡完毕后将核酸蛋白检测仪调零； ②上样用恒流泵进样，将样品泵入柱子，进样时注意不要有气泡； ③清洗用约10倍柱体积结合缓冲液清洗柱子至核酸蛋白检测仪数值不再变化； ④洗脱用5倍柱体积洗脱缓冲液(O.IM Gly-HCl, pH 2. 7)洗脱，此时的峰为免疫球蛋白峰，收集目的产物，待核酸蛋白检测仪数值开始变化时进行收集，待数值降至最低时停止收集，并在收集过程中不停地加入适量中和液(60-200uL，lM Tris-HCl，pH 9. O) JfpH调至7. O ； ⑤平衡用约10倍柱体积结合缓冲液平衡柱子； ⑥用约5倍柱体积20%乙醇清洗柱子，盖好柱子两头盖子，储存于4°C冰箱； ⑦浓缩收集的抗体用50kD的超滤管，4°C，5000g离心超滤； ⑧用Iml左右的PBS将抗体从超滤管上冲下来，分装保存于-20°C。取少量的样品进行抗体浓度及纯度的测定。(4)纯化抗体浓度的测定 应用BCA 蛋白定量试剂盒测定抗体的浓度。(5)纯化抗体纯度的鉴定 应用SDS-PAGE鉴定腹水纯化效果。4. ZEN毒素与ZEN抗独特型单抗间相关性的建立 采用间接竞争ELISA分别建立ZEN和Ab2 β -1D5的标准抑制曲线 ①包被缓冲液将ZEN-BSA稀释至IPg/mL，100 μ L/孔，37 °C孵育3 h ； ②弃反应液，300μ PBST洗板3次，3 min/次； ③加入200μ 5%脱脂奶粉封闭，37°C孵育I h;④弃反应液，300μ PBST洗板3次，3 min/次； ⑤加入50μ 不同浓度的ZEN标准品(0-50ng)或不同浓度Ab20-1D5 (0-2.48 μδ),同时加入50μ 浓度为O. 025Pg/mL的ZEN单克隆抗体，37°C孵育I h ； ⑥弃反应液，300μ PBST洗板3次，3 min/次； ⑦加入100μ 1:4000稀释的!11^标记羊抗鼠186，371孵育40 min ； ⑧弃反应液，300μ PBST洗板5次，3 min/次； ⑨加本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法，所述方法是以ZEN？BSA、ZEN单克隆抗体和ZEN的β型抗独特型单抗建立的竞争ELISA检测方法，其中，所述ZEN单克隆抗体为Ab1？1G4，由杂交瘤细胞1G4G10D3分泌，杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC？NO：C201237；所述ZEN的β型抗独特型单抗为Ab2β？1D5，由杂交瘤细胞株1D5分泌，杂交瘤细胞株1D5于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC？NO：C201238；具体检测方法包括如下步骤：？？？？（A）预包被条的制备：（1）包被：用包被缓冲液即pH9.6的0.05M碳酸钠缓冲液将检测抗原ZEN？BSA稀释至1？μg/mL，每孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，37℃孵育3h；（2）洗涤：倒出微孔板孔中包被缓冲液后，用洗瓶或多通道移液器将200μl？洗涤液加入孔中，3～5min后再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，洗涤3~5次；所述洗涤液为PBS？T；（3）封闭：在微孔板每孔加入150～200μL含0.5%～3％BSA的0.01M？PBS，37℃封闭0.5h～1.5h；（4）按步骤（2）洗涤微孔3～5次；（5）加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h；（6）干燥：微孔板干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存待用；（B）ZEN的检测：（7）每个板孔内分别加入50μl系列浓度的ZEN的β型抗独特型单抗标准液或处理好的样品提取液到微孔中，混匀；（8）？加入50μL？浓度为0.025μg/mL？的ZEN单抗到微孔，混合，37℃孵育1～2h；（9）洗涤微孔3～5次；？（10）加入100？μL1:4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37？℃孵育40？min；（11）洗涤微孔3～5次；（12）每个微孔加入100μL？显色液TMB底物工作液，反应10～20min；（13）每个微孔加入50μL？2M？H2SO4终止反应，并轻轻振荡混匀；（14）在15min内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD值；（15）计算出样品中实际的ZEN的浓度。...
【技术特征摘要】
1.一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法，所述方法是以ZEN-BSA、ZEN单克隆抗体和ZEN的β型抗独特型单抗建立的竞争ELISA检测方法，其中，所述ZEN单克隆抗体为Abl-1G4，由杂交瘤细胞1G4G10D3分泌，杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201237 ;所述ZEN的β型抗独特型单抗为Ab2 β-1D5，由杂交瘤细胞株1D5分泌，杂交瘤细胞株1D5于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO C201238 ； 具体检测方法包括如下步骤 (A)预包被条的制备 (1)包被用包被缓冲液即PH9.6的O. 05M碳酸钠缓冲液将检测抗原ZEN-BSA稀释至IKg/mL，每孔100 μ L加入到聚苯乙烯微孔板中，37°C孵育3h ； (2)洗涤倒出微孔板孔中包被缓冲液后，用洗瓶或多通道移液器将200μI洗涤液加入孔中，3 5min后再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，洗涤3飞次；所述洗涤液为 PBS-T ； (3)封闭在微孔板每孔加入150 200μL含O. 5% 3% BSA的O. OlM PBS，37°C封闭 O. 5h I. 5h ; (4)按步骤(2)洗涤微孔3 5次； (5)加入20%蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宏，宋其芳，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。