一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：称取2mgZER溶于3mL丙酮，加过量碳酸钾10mg和1微升4‑溴丁酸乙酯，在60℃下回流24h；本发明专利技术所述抗原效价高，灵敏性强，且制备方法,操作简单，可工业化生产，实用性强。

Method for preparing complete antigen of corn alcohol

The invention relates to a preparation method of a zearalanol complete antigen, which comprises the following steps: 2mgZER 3mL dissolved in acetone, adding an excess of potassium carbonate and 1 10mg increased 4 bromobutyrate, under the temperature of 60 DEG C reflux 24h; the antigen titer, strong sensitivity, operation the preparation method is simple, and can be industrialized production, strong practicability.

【技术实现步骤摘要】
一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法
本专利技术涉及一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法。
技术介绍
玉米赤霉醇(Zeranol，ZER)又名“右环十四酮酚”，是玉米赤霉菌在生长过程中产生的次生代谢产物玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)的还原产物。由于ZEN在玉米、小麦、高梁等重要农作物中广泛存在，因而玉米赤霉醇可能污染粮食、饲料，最终导致其在动物产品中残留。另外，由于ZER可以提高牛、羊饲料的转化率，增加牛、羊胴体瘦肉率，曾一度作为牛、羊生长促进剂，以埋植形式被广泛使用。虽然ZER在体内大部分会被代谢掉，但仍有一部分会残留在埋植部位。ZER及其代谢产物具有类雌激素作用，能引发动物流产、死胎、甚至不育，还具有肝毒性、免疫毒性、细胞毒性、致畸性和致癌性等[4。6j。1998年，欧盟明确禁止在畜禽养殖过程中使用ZER。中国农业部也在2002年发布的第235号公告中明确规定：禁止在所有食品动物中使用ZER，并且在动物源性食品中不得检出。目前，ZER的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)，由于这2种方法本身一些限制而不能被普及，TLC只能用来做定性分析；HPLC检测尽管比较灵敏、准确，但存在检测仪器贵重、检测费用高、需要专业技术人员操作等缺点。免疫分析技术是当今应用最广的检测方法之一，因其具有快速、灵敏、简便、特异等优点已被广泛应用于食品和饲料中的真菌毒素检测凹。目前，ZER抗体制备及检测报道较少，且检测灵敏度不高。免疫学检测方法的灵敏度主要决定于抗体质量，而要获得高灵敏度抗体，免疫原的制备是关键。对于小分子物质而言，由于免疫原性较弱或没有免疫原性，直接免疫动物不能刺激动物产生抗体。
技术实现思路
本专利技术提出一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法。一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法，包括以下步骤：（1）称取2mgZER溶于3mL丙酮，加过量碳酸钾10mg和1微升4-溴丁酸乙酯，在60℃下回流24h；（2）反应完成后，室温下避光静置2d，抽滤去除沉淀，旋转蒸发干滤液，用2mLΦ=20％的NaOH-甲醇溶液80摄氏度环境下碱解1h，旋转蒸发干溶液；（3）用2mL双蒸水溶解，2mol／L的硫酸调pH3．5，再用2～3mL乙酸乙酯反复萃取5次，弃去水相，用饱和食盐水过滤1次后加无水硫酸钠干燥，抽滤后将溶液旋转蒸发干，收集黄色油状物即为改造好的半抗原，称为ZERO；（4）称取2mgZERO溶于1mL二氧六环，加入1．2扯L三丁胺，4℃冷却15min后加入0．5微升氯甲酸异丁酯，4℃下继续搅拌20min。反应结束后将混合液缓慢滴加入含6mgBSA的溶液中，加入过程在20min内完成；（5）反应1h后用0．5mol／LNaOH溶液将pH调至8．5后继续反应2h；（6）反应产物用2L蒸馏水透析3d，每天换透析液6～8次。透析后所得溶液即为免疫抗原ZERBSA；（7）取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入2mgEDC和1．2mgNHS，室温下搅拌反应2h即为A液；（8）将3mgOVA提前1d用0．5mL的1．3g／L碳酸氢钠溶液溶解，4℃冷藏即为B液；（9）将A溶液缓慢滴加至B液中，室温搅拌2h后把合成产物在0．01mol／L的PBS溶液中透析3d，每天换透析液6～8次，透析后所得溶液即为免疫抗原ZER—OVA。优选地，所述步骤（4）6mgBSA溶解在500微升CBS和500微升二氧六环的混合溶液中。本专利技术所述抗原效价高，灵敏性强，且制备方法,操作简单，可工业化生产，实用性强。具体实施方式实施例1。一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法，包括以下步骤：（1）称取2mgZER溶于3mL丙酮，加过量碳酸钾10mg和1微升4-溴丁酸乙酯，在60℃下回流24h；（2）反应完成后，室温下避光静置2d，抽滤去除沉淀，旋转蒸发干滤液，用2mLΦ=20％的NaOH-甲醇溶液80摄氏度环境下碱解1h，旋转蒸发干溶液；（3）用2mL双蒸水溶解，2mol／L的硫酸调pH3．5，再用2～3mL乙酸乙酯反复萃取5次，弃去水相，用饱和食盐水过滤1次后加无水硫酸钠干燥，抽滤后将溶液旋转蒸发干，收集黄色油状物即为改造好的半抗原，称为ZERO；（4）称取2mgZERO溶于1mL二氧六环，加入1．2扯L三丁胺，4℃冷却15min后加入0．5微升氯甲酸异丁酯，4℃下继续搅拌20min。反应结束后将混合液缓慢滴加入含6mgBSA的溶液中，加入过程在20min内完成；（5）反应1h后用0．5mol／LNaOH溶液将pH调至8．5后继续反应2h；（6）反应产物用2L蒸馏水透析3d，每天换透析液6～8次。透析后所得溶液即为免疫抗原ZERBSA；（7）取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入2mgEDC和1．2mgNHS，室温下搅拌反应2h即为A液；（8）将3mgOVA提前1d用0．5mL的1．3g／L碳酸氢钠溶液溶解，4℃冷藏即为B液；（9）将A溶液缓慢滴加至B液中，室温搅拌2h后把合成产物在0．01mol／L的PBS溶液中透析3d，每天换透析液6～8次，透析后所得溶液即为免疫抗原ZER—OVA。实施例2。一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法，包括以下步骤：（1）称取2mgZER溶于3mL丙酮，加过量碳酸钾10mg和1微升4-溴丁酸乙酯，在60℃下回流24h；（2）反应完成后，室温下避光静置2d，抽滤去除沉淀，旋转蒸发干滤液，用2mLΦ=20％的NaOH-甲醇溶液80摄氏度环境下碱解1h，旋转蒸发干溶液；（3）用2mL双蒸水溶解，2mol／L的硫酸调pH3．5，再用2～3mL乙酸乙酯反复萃取5次，弃去水相，用饱和食盐水过滤1次后加无水硫酸钠干燥，抽滤后将溶液旋转蒸发干，收集黄色油状物即为改造好的半抗原，称为ZERO；（4）称取2mgZERO溶于1mL二氧六环，加入1．2扯L三丁胺，4℃冷却15min后加入0．5微升氯甲酸异丁酯，4℃下继续搅拌20min。反应结束后将混合液缓慢滴加入含6mgBSA的溶液中，加入过程在20min内完成；（5）反应1h后用0．5mol／LNaOH溶液将pH调至8．5后继续反应2h；（6）反应产物用2L蒸馏水透析3d，每天换透析液6～8次。透析后所得溶液即为免疫抗原ZERBSA；（7）取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入2mgEDC和1．2mgNHS，室温下搅拌反应2h即为A液；（8）将3mgOVA提前1d用0．5mL的1．3g／L碳酸氢钠溶液溶解，4℃冷藏即为B液；（9）将A溶液缓慢滴加至B液中，室温搅拌2h后把合成产物在0．01mol／L的PBS溶液中透析3d，每天换透析液6～8次，透析后所得溶液即为免疫抗原ZER—OVA。优选地，所述步骤（4）6mgBSA溶解在500微升CBS和500微升二氧六环的混合溶液中。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）称取2mgZER溶于3mL丙酮，加过量碳酸钾10mg和1微升4‑溴丁酸乙酯，在60℃下回流24h；（2）反应完成后，室温下避光静置2d，抽滤去除沉淀，旋转蒸发干滤液，用2mLΦ=20％的NaOH‑甲醇溶液80摄氏度环境下碱解1h，旋转蒸发干溶液；（3）用2mL双蒸水溶解，2mol／L的硫酸调pH3．5，再用2～3mL乙酸乙酯反复萃取5次，弃去水相，用饱和食盐水过滤1次后加无水硫酸钠干燥，抽滤后将溶液旋转蒸发干，收集黄色油状物即为改造好的半抗原，称为ZERO；（4）称取2mgZERO溶于1mL二氧六环，加入1．2扯L三丁胺，4℃冷却15min后加入0．5微升氯甲酸异丁酯，4℃下继续搅拌20min；反应结束后将混合液缓慢滴加入含6mgBSA的溶液中，加入过程在20min内完成；（5）反应1h后用0．5mol／LNaOH溶液将pH调至8．5后继续反应2h；（6）反应产物用2L蒸馏水透析3d，每天换透析液6～8次；透析后所得溶液即为免疫抗原ZERBSA；（7）取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN，N‑二甲基甲酰胺(DMF)，加入2mgEDC和1．2mgNHS，室温下搅拌反应2h即为A液；（8）将3mgOVA提前1d用0．5mL的1．3g／L碳酸氢钠溶液溶解，4℃冷藏即为B液；（9）将A溶液缓慢滴加至B液中，室温搅拌2h后把合成产物在0．01mol／L的PBS溶液中透析3d，每天换透析液6～8次，透析后所得溶液即为免疫抗原ZER—OVA。...

【技术特征摘要】
1.一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）称取2mgZER溶于3mL丙酮，加过量碳酸钾10mg和1微升4-溴丁酸乙酯，在60℃下回流24h；（2）反应完成后，室温下避光静置2d，抽滤去除沉淀，旋转蒸发干滤液，用2mLΦ=20％的NaOH-甲醇溶液80摄氏度环境下碱解1h，旋转蒸发干溶液；（3）用2mL双蒸水溶解，2mol／L的硫酸调pH3．5，再用2～3mL乙酸乙酯反复萃取5次，弃去水相，用饱和食盐水过滤1次后加无水硫酸钠干燥，抽滤后将溶液旋转蒸发干，收集黄色油状物即为改造好的半抗原，称为ZERO；（4）称取2mgZERO溶于1mL二氧六环，加入1．2扯L三丁胺，4℃冷却15min后加入0．5微升氯甲酸异丁酯，4℃下继续搅拌20min；反应结束后将混合液缓慢滴加入含6mgBSA的溶液中，加入过程在...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝青，
申请(专利权)人：陕西玉航电子有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61