一种糖基化终末产物的简易制备方法技术

本发明专利技术公开一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为50‑70g/L，获得动物血清蛋白溶液；2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛，获得丙酮醛‑动物血清蛋白反应液；丙酮醛‑动物血清蛋白反应液中丙酮醛的浓度为0.6‑10mM；3)将丙酮醛‑动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛‑动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3‑7天；反应后，对丙酮醛‑动物血清蛋白反应液进行纯化，获得糖基化终末产物。采用该方法制备AGEs具有操作简单、成本低廉、易于实现的优点。

A simple preparation method of advanced glycation end products

Simple preparation of the invention discloses a method of advanced glycation end products, which comprises the following steps: 1) the preparation of phosphate buffer, the protein added to animal serum prepared in phosphate buffer solution at concentration 50 70g/L, obtained animal serum protein solution; 2) to join the methylglyoxal animal serum protein solution get in, get methylglyoxal animal serum protein reaction liquid concentration; acetone aldehyde acetone aldehyde animal serum protein in the reaction solution of 0.6 10mM; 3) will methylglyoxal animal serum protein reaction liquid in the container, placed in the environment of 37 DEG C, each 12h to open the container to methylglyoxal animal serum protein reaction liquid in contact with air, and the mixing time, the reaction time was 7 days and 3; after the reaction of acetone aldehyde animal serum protein reaction liquid was purified to obtain advanced glycation end products. AGEs prepared by this method has the advantages of simple operation, low cost and easy implementation.

【技术实现步骤摘要】
一种糖基化终末产物的简易制备方法
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种糖基化终末产物的简易制备方法。
技术介绍
糖尿病(diabetesmellitus,DM)是一个全球性的公共健康问题，其患病人数已从1980年的1亿左右增长到今天的近5亿，而中国的DM发病率还要明显高于世界的平均水平。各种原因引起的胰岛β细胞受损胰岛素合成分泌减少，或胰岛素的信号通路障碍，导致了葡萄糖的储存和利用减少，血糖水平持续升高并出现尿糖，这是DM发生的主要原因。包括葡萄糖和果糖在内的一系列还原糖在代谢过程中会产生大量高活性的二羰基化合物，如丙酮醛(methylglyoxal,MGO)。这些化合物常与生物大分子(如蛋白质、核酸等)结合，形成糖基化终末产物(advancedglycationendproducts,AGEs)，损害组织器官的功能状态。这种效应也是体内“高血糖记忆”的主要原因，即血糖含量虽已经控制在正常水平，但是DM引起的损伤可在一段相当长的时间存在。目前，在DM的建模方面，主要采用以下方法：①用高糖和/或高脂饲养动物模拟人的2型DM发病过程，②将瘦素基因进行纯合突变获得ob/ob的2型DM小鼠，③筛选自发性瘦素受体突变的小鼠可得到db/db的2型DM小鼠，④用化学药物(如链脲佐菌素，四氧嘧啶等)选择性地损害实验动物的胰岛β细胞从而造成1型DM模型，⑤用高糖、MGO或AGEs处理细胞可以制备DM的细胞模型。对于建模方法⑤，使用AGEs要比高糖和MGO更能模拟DM的真实过程，研究结果也更具说服力。对于AGEs，传统方式采用葡萄糖或果糖和牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)反应制备，然而，这种方法周期较长，制备率较低，往往导致实验结果不稳定。AGEs是建立2型DM体外细胞模型和整体动物实验模型的关键试剂，然而，市面上提供AGEs的商业化试剂公司较少。另外，个别提供AGEs的试剂公司对其要价极高，如BioVision公司提供的AGEs(No.2221-10)每10mg售价295美元。如此高的价格在某种程度上限制了它的广泛应用。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供AGEs的一种简易制备方法，该方法用相对较便宜的动物血清蛋白和丙酮醛作为原料，生产出含量高，质量稳定的AGEs，显著的降低了AGEs的价格。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种糖基化终末产物的简易制备方法包括如下步骤：1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为50-70g/L，获得动物血清蛋白溶液；2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；丙酮醛-动物血清蛋白反应液中丙酮醛的浓度为0.6-10mM；3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气并搅拌混匀一次，反应时间为3-7天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行纯化，获得糖基化终末产物。优选地，步骤3)所述对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行纯化具体为采用透析袋对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析，去除游离的丙酮醛。优选地，还包括步骤4)，具体为对透析后的糖基化终末产物溶液进行含量测定。优选地，步骤4)所述含量测定的方法为对比糖基化终末产物溶液与动物血清蛋白溶液的颜色差异；若与动物血清蛋白溶液相比，糖基化终末产物溶液颜色变为棕色则表明生成了糖基化终末产物，颜色越深则表明糖基化终末产物含量越高。优选地，步骤4)所述含量测定的方法为：对糖基化终末产物溶液与动物血清蛋白溶液的颜色分别进行灰度分析，利用假设检验获得P值，当P值小于0.05表明已生成糖基化终末产物。优选地，步骤4)所述含量测定的方法为：采用荧光酶标仪对糖基化终末产物溶液进行含量检测，检测所用激发波长340nm，发射波长465nm。优选地，步骤1)所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.61g、KH2PO40.2g和NaCl8.0g，加DI-H2O800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液。优选地，步骤1)所述的动物血清蛋白为牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白中的一种。优选地，一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为50-70g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的浓度为10mM，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析除去游离的丙酮醛，获得糖基化终末产物；4)采用荧光酶标仪对糖基化终末产物溶液进行含量检测，检测所用激发波长340nm，发射波长465nm。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术采用相对较便宜的动物血清蛋白和丙酮醛作为原料，生产出含量高，质量稳定的AGEs，显著的降低了AGEs的价格。2.本专利技术通过采用动物血清蛋白和丙酮醛作为原料，制备AGEs，该方法操作简单，不需采用大型昂贵精密仪器，容易实现，具有易于操作、应用范围广的优点。附图说明图1为本专利技术的定性定量检测图。其中图1包括A部分、B部分、C部分。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述：实施例1：一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为60g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.61g、KH2PO40.2g和NaCl8.0g，加DI-H2O800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液；2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的浓度为0.6mM，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析除去游离的丙酮醛，获得糖基化终末产物。实施例2：一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为60g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.61g、KH2PO40.2g和NaCl8.0g，加DI-H2O800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液；2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的浓度为1.2mM，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糖基化终末产物的简易制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为50‑70g/L，获得动物血清蛋白溶液；2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛，获得丙酮醛‑动物血清蛋白反应液；丙酮醛‑动物血清蛋白反应液中丙酮醛的浓度为0.6‑10mM；3)将丙酮醛‑动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛‑动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3‑7天；反应后，对丙酮醛‑动物血清蛋白反应液进行纯化，获得糖基化终末产物。

【技术特征摘要】
1.一种糖基化终末产物的简易制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为50-70g/L，获得动物血清蛋白溶液；2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；丙酮醛-动物血清蛋白反应液中丙酮醛的浓度为0.6-10mM；3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3-7天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行纯化，获得糖基化终末产物。2.根据权利要求1所述的糖基化终末产物的简易制备方法，其特征在于，步骤3)所述对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行纯化具体为采用透析袋对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析，去除游离的丙酮醛。3.根据权利要求1所述的糖基化终末产物的简易制备方法，其特征在于，还包括步骤4)，具体为对透析后的糖基化终末产物溶液进行含量测定。4.根据权利要求3所述的糖基化终末产物的简易制备方法，其特征在于，步骤4)所述含量测定的方法为对比糖基化终末产物溶液与动物血清蛋白溶液的颜色差异；若与动物血清蛋白溶液相比，糖基化终末产物溶液颜色变为棕色则表明生成了糖基化终末产物，颜色越深则表明糖基化终末产物含量越高。5.根据权利要求3所述的糖基化终末产物的简易制备方法，其特征在于，步骤4)所述含量测定的方法为：对糖基化终末产物溶液与动物血清蛋白溶液的颜色分别进行灰度分析，利用假设检验获得P值，当P值小于0.05表明已生成糖基化终末...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春涛，孟富慧，张辉，陈利，李翔，
申请(专利权)人：广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44