一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法。检测时，DNA糖基化酶hOGG1会特异性识别并切除损伤鸟嘌呤，留下一个脱碱基位点，脱嘌呤核酸内切酶‑1会对脱碱基位点进一步剪切，留下一个核苷酸的缺口，DNA聚合酶β将Cy5‑dGTP聚合在该缺口处，生成双标记的双链核苷酸底物，通过生物素与链霉亲合素之间的特异性反应，DNA底物会结合在覆盖有链霉亲合素的量子点的表面，形成QD‑DNA‑Cy5复合物，空间距离缩小，导致量子点和Cy5之间发生荧光共振能量转移，从而可以在单分子水平观察到Cy5的荧光信号。本发明专利技术所述检测方法简单、快速、灵敏，检测下限可达1.8×10‑6U/μL。

【技术实现步骤摘要】
一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法
本专利技术属于生物分析
，具体涉及一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法。
技术介绍
基因组DNA完整性的维持对于物种的稳定具有十分重要的意义，但在现实生活中，基因组DNA不可避免地受到来自体内外各种因素的影响，外源的如辐射(UV)、化学诱变剂等，内源的如活性氧化物质(ROS)等，这些因素会导致DNA单、双链断裂，错配，碱基缺失，从而破坏基因组完整性，影响物种的生存。为了减少DNA损伤，生物体在进化过程中形成了多种损伤修复机制，仅针对单碱基突变就有错配修复(MMR)，碱基切除修复(BER)，核苷酸切除修复(NER)等，其中碱基切除修复(BER)是修复碱基氧化损伤最重要方式。而启动碱基切除修复(BER)过程最关键的一步就是由DNA糖基化酶催化完成的。DNA糖基化酶是一类负责损伤碱基识别和碱基切除启动的酶类，它的功能异常会导致切除修复机制无法运行，从而引发各种疾病。如在帕金森病人体内可检测到DNA糖基化酶hOGG1有较高的活性。据报道可知，DNA糖基化酶hOGG1与多种癌症如肺癌、乳腺癌、胃癌、胆囊癌、膀胱癌以咽喉癌都有着密切的关联，因此DNA糖基化酶hOGG1是重要的生物标志物之一。高灵敏地检测DNA糖基化酶活性对于癌症等相关疾病的早期诊断和药物筛选有重要的意义。现有的DNA糖基化酶hOGG1活性检测技术主要包括凝胶电泳(gelelectrophoresis)，放射性标记(radiolabeling)，质谱分析(MS)，以及高效液相色谱分析(HPLC)。这些检测方法十分有效，但是非常的耗时，操作繁琐，而且存在安全隐患。为了克服以上缺点，近年来也发展了以纳米技术为基础的比色检测法以及各种荧光染料为基础的荧光探针检测法，如CN105132522A公开了DNA三向节活化的杂交链式反应用于尿嘧啶DNA糖基化酶的高灵敏检测，以DNA糖基化酶UDG为模型，开发了发夹重构的识别机制，将DNA修饰酶对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，从而引起DNA的自组装过程，并实现了通用性DNA纳米器件的构建，该器件能够用于DNA修饰酶(尤其是UDG)的高灵敏检测，其中UDG的检测下限达到0.000043U/mL；CN104630363A公开了一种基于免标记无酶DNA机器荧光放大策略检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的方法，采用包含尿嘧啶碱基和引发序列的双链DNA(dsDNA)探针识别UDG目标物并伴随引发链的释放，该引发链可激活免标记无酶DNA机器，产生放大的荧光信号，由于dsDNA探针及特定DNA机器设计，检测方法成功实现了背景降低和信号放大，产生了低的检测限(0.00044U/mL)；但是纳米颗粒处理麻烦，耗时长，操作复杂且检测灵敏度不高，而荧光检测法常常存在荧光探针设计较难且成本较高，检测灵敏度提高有限的缺点。最近发展的单分子检测技术，因其信噪比高，所耗样品量少，检测灵敏度以及分辨率高等优点已成为当今世界前沿科技的研究热点之一。将单分子检测技术应用于生物标志物的超灵敏检测，可实现对疾病的早期诊断和治疗，在临床医学领域具有广阔的应用前景。如何设计有效的检测策略从而实现高效、快速、灵敏的检测DNA糖基化酶活性，是本领域内亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的上述问题，专利技术人提出一种简单、快速、灵敏的基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法。具体的，本专利技术涉及以下技术方案：首先，本专利技术提供一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶hOGG1活性的方法，所述方法包括如下步骤：(1)待测DNA糖基化酶hOGG1介导的双链DNA底物的碱基切除修复：双链DNA底物中加入待测DNA糖基化酶hOGG1、脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)、DNA聚合酶β和标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5-dGTP)；所述双链DNA底物为长度15-60bp的双链DNA，其作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，它的互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，双链DNA的其他碱基不为8-氧鸟嘌呤；通过DNA糖基化酶hOGG1特异性地识别双链DNA底物中8-氧鸟嘌呤，并切除损伤8-氧鸟嘌呤，在双链DNA上留下一个脱碱基位点(APsite)；脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)对脱碱基位点(APsite)进行剪切，在该位点处留下一个核苷酸的缺口；DNA聚合酶β将标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5-dGTP)聚合在缺口处，最终生成具有Cy5和生物素双标记的修复反应产物；(2)修复反应产物与量子点(QDs)混合孵育反应：所述量子点表面覆盖有链霉亲合素；(3)单分子检测Cy5荧光信号，定量分析DNA糖基化酶hOGG1活性：采用全内角反射荧光技术(TIRF)的单分子成像系统进行检测。本专利技术所述检测方法的原理为：所述方法设计一个长度15-60bp的双链DNA作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，它的互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)(双链DNA的其他碱基不为8-氧鸟嘌呤)。在DNA糖基化酶hOGG1存在时，其会特异性地识别8-氧鸟嘌呤，并切除损伤碱基，在双链DNA上留下一个脱碱基位点(APsite)。引入脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)，对脱碱基位点(APsite)进行剪切，从而在该位点处留下一个核苷酸的缺口。在DNA聚合酶β的作用下，标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5-dGTP)会被聚合在缺口处，从而生成Cy5和生物素双标记的双链核苷酸底物。生物素与链霉亲合素发生特异性反应，双标记的DNA底物结合在覆盖有链霉亲合素的量子点(QDs)的表面，形成QD-DNA-Cy5的复合物，从而导致量子点(QDs)和Cy5之间的荧光共振能量转移(FRET)。通过全内角反射荧光技术(TIRF)，简单统计Cy5数目就可以在单分子水平上对DNA糖基化酶hOGG1活性进行定量检测。当DNA糖基化酶hOGG1不存在时，由DNA糖基化酶hOGG1所引发的碱基切除修复不会启动，因而Cy5和量子点(QDs)之间也不会发生荧光共振能量转移(FRET)，最终也就观察不到Cy5的荧光信号。由于一个量子点可以同时结合多个标记Cy5的核苷酸底物，导致Cy5和量子点(QDs)之间的荧光共振能量转移(FRET)效率很高，而基于全内角反射荧光(TIRF)的单分子检测技术又具有较高的灵敏性和较高的分辨率，因此该方法可以实现高效、快速、灵敏地检测DNA糖基化酶的活性。其中，本专利技术所述双链DNA底物的有效长度范围15bp-60bp，小于15bp不利于常温下双链DNA引物的稳定性；而大于60bp，双链DNA引物可能会形成二聚体或空间二级结构，不利于其在量子点(QDs)表面的均匀分布，影响荧光分子与量子点(QDs)之间荧光共振能量转移(FRET)效率；双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，基于发生荧光共振能量转移的需要，它的互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)。优选的，本专利技术所述双链DNA底物的长度为25bp，构成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶hOGG1活性的方法，所述方法包括如下步骤：(1)待测DNA糖基化酶hOGG1介导的双链DNA底物的碱基切除修复：双链DNA底物中加入待测DNA糖基化酶hOGG1、脱嘌呤核酸内切酶‑1(APE1)、DNA聚合酶β和标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5‑dGTP)；所述双链DNA底物为长度15‑60bp的双链DNA，其作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，互补链距离5′端12个碱基处为损伤8‑氧鸟嘌呤(8‑oxoG)，双链DNA的其他碱基不为8‑氧鸟嘌呤；通过DNA糖基化酶hOGG1特异性地识别双链DNA底物中8‑氧鸟嘌呤，并切除损伤8‑氧鸟嘌呤，在双链DNA上留下一个脱碱基位点(AP site)；脱嘌呤核酸内切酶‑1(APE1)对脱碱基位点(AP site)进行剪切，在该位点处留下一个核苷酸的缺口；DNA聚合酶β将标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5‑dGTP)聚合在缺口处，最终生成具有Cy5和生物素双标记的修复反应产物；(2)修复反应产物与量子点(QDs)混合孵育反应：所述量子点表面覆盖有链霉亲合素；(3)单分子检测Cy5荧光信号，定量分析DNA糖基化酶hOGG1活性：采用全内角反射荧光技术(TIRF)的单分子成像系统进行检测。...

【技术特征摘要】
1.一种非疾病治疗诊断目的的基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶hOGG1活性的方法，所述方法包括如下步骤：(1)待测DNA糖基化酶hOGG1介导的双链DNA底物的碱基切除修复：双链DNA底物中加入待测DNA糖基化酶hOGG1、脱嘌呤核酸内切酶-1、DNA聚合酶β和标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸；所述双链DNA底物为长度25bp的双链DNA，其作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤，双链DNA的其他碱基不为8-氧鸟嘌呤；通过DNA糖基化酶hOGG1特异性地识别双链DNA底物中8-氧鸟嘌呤，并切除8-氧鸟嘌呤，在双链DNA上留下一个脱碱基位点；脱嘌呤核酸内切酶-1对脱碱基位点进行剪切，在该位点处留下一个核苷酸的缺口；DNA聚合酶β将标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸聚合在缺口处，最终生成具有Cy5和生物素双标记的修复反应产物；构成双链DNA底物的两条序列分别为正义链：5'-CTCCTCCCCCATCTCCTCCCAGTCC-biotin-3'和反义链：5'-GGACTGGGAGGAOATGGGGGAGGAG-3'，O为8-氧鸟嘌呤；(2)修复反应产物与量子点混合孵育反应：所述量子点表面覆盖有链霉亲合素；(3)单分子检测Cy5荧光信号，定量分析DNA糖基化酶hOGG1活性：采用全内角反射...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，唐波，王黎娟，马飞，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37