用作下游蛋白质糖重构的底物的去糖基化的重组蛋白质的体内制备的方法技术

本发明专利技术包括降低蛋白质的糖基化的组合物和方法，包括：获得表达一种或多种蛋白质的细胞，所述蛋白质包括一个或多个糖基化位点并且被糖基化；在细胞中表达一种或多种糖苷酶切割来自一种或多种蛋白质的一个或多个糖基；和分离来自细胞的具有降低的糖基化的一种或多种蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用该非临时专利申请要求于2013年12月18日提交的题为“用作下游蛋白质糖重构的底物的去糖基化的重组蛋白质的体内制备的方法”的第61/917,793系列号美国临时专利申请的优先权，以引用方式将其全部内容并入本文。专利技术的
本专利技术一般地涉及翻译后蛋白质修饰的领域，更具体地，涉及在体内制备具有降低的糖基化的蛋白质。引入光盘上提交的材料作为参考无。专利技术背景在不限制本专利技术的范围的情况下，结合蛋白质糖基化描述其背景。连接到治疗性蛋白质的N-糖基化的性质是蛋白质同一性的关键属性，因为该性质可以影响其治疗活性、稳定性和免疫原特性。重组蛋白质的N-聚糖图谱取决于用于其制备的宿主和宿主培养条件。对导致理想地由一种单一的最佳糖型构成的均质和一致的治疗性糖蛋白的产生的生产方法存在日益增加的需求。例如，无岩藻糖基化的单克隆抗体具有升高的细胞毒活性。此外，用作治疗剂的人血清蛋白通常需要人类特异性唾液酸化，这仍然是在异源表达系统中均匀地产生的一个挑战。已由他人提出体外治疗学糖重构技术来满足糖工程化治疗学的需求(Huang,W.,Giddens,J.,Fan,S.,Toonstra,C.,&Wang,L.(2012).ChemoenzymaticglycoengineeringofintactIgGantibodiesforgainoffunctions.JournaloftheAmericanChemicalSociety,134,12308–12318；和Wang,L.,&Lomino,J.V.(2012).Emergingtechnologiesformakingglycan-definedglycoproteins.ACSchemicalbiology,7(1),110–22)。教导的方法需要提取和纯化关注的糖蛋白，以第一N-乙酰氨基葡萄糖((GlcNAc)和岩藻糖如果连接的化仍然连接到蛋白质的天冬酰胺的方式的蛋白质的去糖基化，和使用专用内切糖苷酶S(EndoS)突变体，用选择的纯化的或合成的激活的N-聚糖给体蛋白质的再糖基化。去糖基化和再糖基化步骤之前和之后是纯化步骤，这使得糖重构过程费力和昂贵的(参见图1选项A，和图2A，标记为现有技术)。糖重构方法教导于例如授予DeFrees等人的第8,361,961号、第7,956,032号、第7,696,163号和第7,338,933号美国专利，包括用于重构肽分子的方法和组合物，包括向肽添加或删除一个或多个糖基，和/或向肽添加修饰基团，肽的O-连接的糖基化和蛋白质的糖聚乙二醇化。另一种方法教导于Wang等人提交的题为TransglycosylationActivityOfGlycosynthaseMutantsOfAnEndo-Beta-N-Acetylglucosaminidase(Endo-D)FromStreptococcusPneumoniae的第20130137857号美国专利申请。简言之，认为该专利技术包括显示针对糖蛋白合成的降低的水解活性和升高的转糖基活性的重组Endo-D和选择的突变体，其中通过转糖基化将希望的糖链添加到核心无岩藻糖基化的或非无岩藻糖基化的GlcNAc-蛋白质受体。认为这样的重组Endo-D和选择的突变体对于有效的IgG1-Fc结构域的糖基化重构是有用的。又一种方法教导于Strome等人提交的题为GlycosylationEngineeredAntibodyTherapy的第20100173323号美国专利申请。简言之，认为该申请教导了产生糖基化工程化的抗体的方法，以及使用糖基化-工程化的抗体治疗患者的方法，特别是癌症患者或患有免疫疾病或障碍的患者。该专利技术还包括产生糖基化-工程化的抗体以用于治疗不响应常规抗体疗法的具有多态性的患者的方法，通过糖基化工程化改善生物活性的方法，和使用糖基化-工程化的抗体调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法。专利技术概述在一个实施方案中，本专利技术包括一种降低蛋白质的糖基化的方法，包括：获得表达一种或多种蛋白质的细胞，所述蛋白质包括一个或多个糖基化位点并且被糖基化；在细胞中表达一种或多种糖苷酶，所述糖苷酶切割一个或多个来自所述一种或多种蛋白质的糖基以降低蛋白质的糖基化，其中所述糖苷酶；和分离来自细胞的具有降低的糖基化的一种或多种蛋白质。在一个方面中，一种或多种蛋白质中的至少一种，或一种或多种糖苷酶中的一种或多种是瞬时表达的。在另一个方面中，所述细胞为植物细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞。在另一个方面中，所述一种或多种蛋白质为抗体、抗体片段、生长因子、淋巴因子、酶、受体、受体结合蛋白、核酸结合蛋白、结构蛋白、孔、通道、激酶、磷酸酶或G-蛋白。在另一个方面中，所述一种或多种糖苷酶被重组修饰以进一步包括使一种或多种糖苷酶靶向进入引起蛋白质的糖基化的蛋白质加工的特定细胞区室的部分。在另一个方面中，所述一种或多种糖苷酶被序列重组修饰，所述序列使得糖苷酶靶向进入内质网，或穿过内质网靶向进入囊泡。在另一个方面中，所述一种或多种糖苷酶选自葡糖苷酶、木聚糖酶、唾液酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、神经氨酸苷酶、转化酶、透明质酸酶和溶菌酶。在另一个方面中，所述一种或多种糖苷酶选自以下至少一种：内切糖苷酶(例如，EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoD、EndoH、EndoM、EndoS)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α1-2岩藻糖苷酶、α1-2,3甘露糖苷酶、α1-3,6半乳糖苷酶、α2-3神经氨酸苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶f、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、O-糖苷酶、神经氨酸苷酶、N糖苷肽酶F,N糖苷肽酶A,胎球蛋白、O-糖苷酶、神经氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶或β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。在另一个方面中，所述方法还包括在体外或体内分离后将新的糖基化添加到一种或多种蛋白质的步骤。在另一个方面中，所述细胞组成性表达所述一种或多种蛋白质、一种或多种糖苷酶或两者。在另一个实施方案中，本专利技术包括降低蛋白质的糖基化的方法，包括：共表达一种或多种蛋白质，所述蛋白质包含一个或多个糖基化位点并且在细胞中被一种或多种糖苷酶糖基化，其中所述一种或多种糖苷酶起到降低或消除细胞中的一种或多种蛋白质的糖基化的作用；和纯化来自细胞的一种或多种蛋白质，其中所述糖苷酶对一种或多种蛋白质上的糖基化起作用。在另一个方面中，一种或多种蛋白质中的至少一种，或一种或多种糖苷酶中的一种或多种是瞬时表达的。在另一个方面中，所述细胞为植物细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞。在另一个方面中，所述关注的蛋白质为抗体、抗体片段、生长因子、淋巴因子、酶、受体、受体结合蛋白、核酸结合蛋白、结构蛋白、孔、通道、激酶、磷酸酶或G-蛋白。在另一个方面中，所述一种或多种糖苷酶被重组修饰以进一步包括使一种或多种糖苷酶靶向进入引起蛋白质的糖基化的蛋白质加工的特定细胞区室的部分。在另一个方面中，所述一种或多种糖苷酶被序列重组修饰，所述序列使得糖苷酶靶向进入内质网，或穿过内质网靶向进入囊泡。在另一个方面中，所述一种或多种糖苷酶选自葡糖苷酶、木聚糖酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、蔗糖酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降低蛋白质的糖基化的方法，包括：获得表达一种或多种蛋白质的细胞，所述蛋白质包括一个或多个糖基化位点并且被糖基化；在细胞中表达一种或多种糖苷酶，所述糖苷酶切割一个或多个来自所述一种或多种蛋白质的糖基以降低蛋白质的糖基化，其中所述糖苷酶；和分离来自细胞的具有降低的糖基化的一种或多种蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.18 US 61/917,793;2014.12.12 US 14/569,5011.一种降低蛋白质的糖基化的方法，包括：获得表达一种或多种蛋白质的细胞，所述蛋白质包括一个或多个糖基化位点并且被糖基化；在细胞中表达一种或多种糖苷酶，所述糖苷酶切割一个或多个来自所述一种或多种蛋白质的糖基以降低蛋白质的糖基化，其中所述糖苷酶；和分离来自细胞的具有降低的糖基化的一种或多种蛋白质。2.权利要求1所述的方法，其中一种或多种蛋白质中的至少一种，或一种或多种糖苷酶中的一种或多种是瞬时表达的。3.权利要求1所述的方法，其中所述细胞为植物细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞。4.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质为抗体、抗体片段、生长因子、淋巴因子、酶、受体、受体结合蛋白、核酸结合蛋白、结构蛋白、孔、通道、激酶、磷酸酶或G-蛋白。5.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种糖苷酶被重组修饰以进一步包括使一种或多种糖苷酶靶向进入引起蛋白质的糖基化的蛋白质加工的特定细胞区室的部分。6.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种糖苷酶被序列重组修饰，所述序列使得糖苷酶靶向进入内质网，或穿过内质网靶向进入囊泡。7.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种糖苷酶选自葡糖苷酶、木聚糖酶、唾液酸酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、神经氨酸苷酶、转化酶、透明质酸酶和溶菌酶。8.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种糖苷酶选自以下至少一种：内切糖苷酶(例如，EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoD、EndoH、EndoM、EndoS)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α1-2岩藻糖苷酶、α1-2,3甘露糖苷酶、α1-3,6半乳糖苷酶、α2-3神经氨酸苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶f、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、O-糖苷酶、神经氨酸苷酶、N糖苷肽酶F、N糖苷肽酶A、胎球蛋白、O-糖苷酶、神经氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶或β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。9.权利要求1所述的方法，还包括在体外或体内分离后将新的糖基化添加到一种或多种蛋白质的步骤。10.权利要求1所述的方法，其中所述细胞组成性表达所述一种或多种蛋白质、一种或多种糖苷酶或两者。11.一种降低蛋白质的糖基化的方法，包括：共表达一种或多种蛋白质，所述蛋白质包含一个或多个糖基化位点并且在细胞中被一种或多种糖苷酶糖基化，其中所述一种或多种糖苷酶起到降低或消除细胞中的一种或多种蛋白质的糖基化的作用；和纯化来自细胞的一种或多种蛋白质，其中所述糖苷酶对一种或多种蛋白质上的糖基化起作用。12.权利要求11所述的方法，其中一种或多种蛋白质中的至少一种，或一种或多种糖苷酶中的一种或多种是瞬时表达的。13.权利要求11所述的方法，其中所述细胞为植物细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞。14.权利要求11所述的方法，其中所述关注的蛋白质为抗体、抗体片段、生长因子、淋巴因子、酶、受体、受体结合蛋白、核酸结合蛋白、结构蛋白、孔、通道、激酶、磷酸酶或G-蛋白。15.权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种糖苷酶被重组修饰以进一步包括使一种或多种糖苷酶靶向进入引起蛋白质的糖基化的蛋白质加工的特定细胞区室的部分。16.权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种糖苷酶被序列重组修饰，所述序列使得糖苷酶靶向进入内质网，或穿过内质网靶向进入囊泡。17.权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种糖苷酶选自葡糖苷酶、木聚糖酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、神经氨酸苷酶、转化酶、透明质酸酶和溶菌酶。18.权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种糖苷酶选自以下至少一种：内切糖苷酶(例如，EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoD、EndoH、EndoM、EndoS)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α1-2岩藻糖苷酶、α1-2,3甘露糖苷酶、α1-3,6半乳糖苷酶、α2-3神经氨酸苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶f、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、O-糖苷酶、神经氨酸苷酶、N糖苷肽酶F、N糖苷肽酶A、胎球蛋白、O-糖苷酶、神经氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶或β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。19.权利要求11所述的方法，还包括在体外或体内纯化后将新的糖基化添加到一种或多种蛋白质的步骤。20.权利要求11所述的方法，还...

【专利技术属性】
技术研发人员：S马塞尔，L贝内特，
申请(专利权)人：凯立博生物疗法公司，
类型：发明
国别省市：美国;US