鉴定蛋白质的糖基化修饰位点的方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴定蛋白质的糖基化修饰位点的方法，包括以下步骤：富集带有糖基化修饰的蛋白质或多肽；去除所述蛋白质或多肽的糖基化修饰；用亲核试剂标记糖基化修饰位点；利用质谱分析已被亲核试剂标记的蛋白质或多肽。通过将富集方法与替换糖基化修饰的方法相联用，得到糖基化修饰位点被其他分子量更小且结合稳定的标签所标记的富集的蛋白质，该蛋白质有利于下游的质谱鉴定修饰位点和定量分析修饰水平的变化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分析方法，具体而言，涉及一种鉴定蛋白质的修饰位点的方法。
技术介绍
随着2000年6月国际人类基因组计划的完成，人类开始从基因组时代步入后基因组时代，在后基因组时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，基因的功能是靠其功能的执行者-蛋白质来实施的，因而对蛋白质的表达量、定位、修饰状态以及蛋白质之间相互作用的研究成为后基因组时代的热点研究领域。在生命体内，蛋白质在发挥功能之前需要经过基因的转录、翻译、翻译后修饰过程，并转运到细胞或组织内特定的部位发挥功能。大多数蛋白质在发生翻译后修饰之前是没有活性的，也就是说，蛋白质的翻译后修饰对于执行蛋白质特定的功能是极其重要的，它使特定蛋白质的结构更加复杂、功能更加完备、调控机制也更加精细。目前在真核细胞中存在20多种翻译后修饰的形式，比较常见的有磷酸化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰、甲基化修饰等，本技术方案的研究对象是一种特殊的蛋白质糖基化修饰即O型乙酰葡萄糖胺化修饰(O-GlcNAc)。细胞内许多关键的蛋白都会发生糖基化修饰，糖基化修饰会影响蛋白的结构与功能，参与许多重要的生物过程，如免疫应答、病毒的复制和侵染、细胞生长和分化等(参见 Love, D.C.&Hanover, J.A.The hexosamine signaling pathway:deciphering the O-GlcNAc code .Sci STKE 2005，rel3 (2005)和 Love，D.C.，Krause，M.W.&Hanover, J.A.0-GlcNAc cycling !emerging roles in development andepigenetics.Seminars in cell&developmental biology 21，646-654.)。在细胞内，糖基化修饰包括O型糖基化修饰、N型糖基化修饰和C型糖基化修饰等多种方式。O型乙酰葡萄糖胺化属于O型糖 基化修饰，它是把单一的糖单元即乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)连接到蛋白质上特定的丝氨酸或苏氨酸残基。O-GlcNAc修饰是一种存在于细胞核和细胞质蛋白上的动态的修饰方式，此修饰方式和被广泛研究的磷酸化修饰有许多相似之处，经常发生在与磷酸化相近甚至相同的位置，与磷酸化修饰具有‘阴阳调节’的关系，并在细胞内担当营养感受器和压力感受器的角色，被认为是细胞内信号传递和基因转录的关键调控方式(Wang，Z., Gucek, M.&Hart, G.ff.Cross-talk between GlcNAcylation and phosphorylation:site-specific phosphorylation dynamics in response to globally elevatedO-GlcNAc.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States ofAmerica 105，13793-13798 (2008))。除此之外，不断有新的证据表明异常的O-GlcNAc修饰和糖尿病、癌症等的发生有密切关系。O型乙酰葡萄糖胺化修饰对体内众多的生物过程都有重要的影响，然而对于带有Ο-GlcNAc修饰的蛋白，目前鉴定的数目很有限，这主要是因为存在以下几个方面的技术难题:首先，相对于绝大部分的其他定位于细胞外和管腔中的糖修饰蛋白，O-GlcNAc修饰的蛋白质几乎全都存在于细胞质和细胞核，如转录因子、细胞骨架蛋白、核孔蛋白等，大多含量很低，而且这一修饰是不稳定的且高度变化的，在不同的生理刺激如激素、生长因子、分裂素等的刺激下，Ο-GlcNAc修饰会像磷酸化修饰一样在特定的位点发生量的改变并快速得循环，这些特性都对分析技术的灵敏度提出了更高的要求；其次，O-GlcNAc修饰基团在质谱检测中很容易从连接的氨基酸上断裂，这使得质谱的分析和鉴定工作也增加了难度；第三则是因为O-GlcNAc结构简单，通常不会被修饰或加长成更加复杂的结构，并且在提取的过程中易被释放的酶水解，增加了富集的难度。在多年的研究过程中研究者们提出了许多的方法和技术以部分解除以上提及的困难，其中比较经典的有化学酶标记，基于免疫亲和或凝集素的富集方法。然而，这些方法都存在各自的缺陷。在早期的研究中，鉴定Ο-GlcNAc修饰位点是一项繁重而且耗时间的过程，经常要花接近一年的时间。在一些早期的研究中，最早用于研究O型乙酰葡萄糖胺的方法是在体外利用半乳糖转移酶以UDP-3[H]半乳糖为底物将3[H]半乳糖转移到乙酰葡萄糖胺的 4 位轻基上(Torres, C.R.&Hart, G.ff.Topography and polypeptide distribution ofterminal N-acetyIglucosamine residues on the surfaces of intact lymphocytes.Evidence for 0-1 inked GlcNAc.The Journal of biological chemistry 259，3308-3317 (1984))，随后经用自动的Edman降解来为肽段测序，接着用人工的Edman降解来决定哪一个残基上含放射性标记，从而间接获得Ο-GlcNAc的修饰位点。但是，该技术需要使用非常昂贵的放射性糖核苷酸和相应的特殊设备，实验成本大幅度上升；其次是需要做多次高效液相色谱和Edman降解才有可能鉴定一种蛋白上主要的Ο-GlcNAc位点；第三，样品需要量大，所有的实验步骤的难度均较高，整个过程耗时耗力。早期研究Ο-GlcNAc是基于用传统的放射性的半乳糖对其进行酶标检测，这种方法灵敏性不高，并且需要大量的纯化蛋白因而耗费大量的人力。运用质谱技术可以直接观察Ο-GlcNAc位点，但是很难，因为在碰撞能诱导的解离过程中，由于糖苷键很不稳定会从肽段上断裂下来。现有的经过改进的鉴定O-GlcNAc修饰位点的方法中，为了排除位于丝氨酸或者苏氨酸上的磷酸化或者其他修饰的干扰，通常首先要对O-GlcNAc修饰蛋白进行特异性富集。最简单的ο-GlcNAc富集法就是利用抗体的免疫亲和或者凝集素色谱来纯化O-GlcNAc修饰的蛋白。针对O-GlcNAc的抗体主要有RL2和CTD110.6。RL2是由核孔蛋白复合体片段作为抗原诱导产生的免疫球蛋白G(IgG)单克隆抗体。CTD110.6是一种免疫球蛋白M(IgM)单克隆抗体，以化学合成带有Ο-GlcNAc的肽段RNAP II羧基末端结构域(CTD)的单一重复序列作为抗原诱导产生。经过琥珀酰化的麦胚凝集素对末端是GlcNAc的糖链具有较高的亲和力，因此可以用来富集带Ο-GlcNAc修饰的蛋白质。但是，使用抗体或凝集素的方法富集带有Ο-GlcNAc修饰的蛋白，其效率比较低，而且存在与其他类糖基化修饰的交叉反应。例如，琥珀酰化的麦胚凝集素也会结合末端含有Ο-GlcNAc的其他多糖蛋白，使Ο-GlcNAc修饰蛋白的鉴定增加假阳性。基于抗体的富集手段往往只能对一部分Ο-GlcNAc修饰的蛋白才有效，这是因为抗体与Ο-Gl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定蛋白质的糖基化修饰位点的方法，包括以下步骤：富集带有糖基化修饰的蛋白质或多肽；去除所述蛋白质或多肽的糖基化修饰；用亲核试剂标记糖基化修饰位点；利用质谱分析已被亲核试剂标记的蛋白质或多肽。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定蛋白质的糖基化修饰位点的方法，包括以下步骤:富集带有糖基化修饰的蛋白质或多肽；去除所述蛋白质或多肽的糖基化修饰；用亲核试剂标记糖基化修饰位点；利用质谱分析已被亲核试剂标记的蛋白质或多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过β_消除-马氏加成替代反应实施去除所述蛋白质或多肽的糖基化修饰的步骤和用亲核试剂标记糖基化修饰位点的步骤。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖基化修饰是O型乙酰葡萄糖胺化修饰。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述富集步...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶子和，水雯箐，杨诚，徐金华，
申请(专利权)人：天津市国际生物医药联合研究院，南开大学生命科学学院，
类型：发明
国别省市：