本文公开了在输卵管组织中产生具有修饰寡糖结构的蛋白质的转基因禽类，以及产生这种禽类的方法。本发明专利技术还包含转基因个体中产生的修饰的蛋白质。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】禽类的糖基化 本申请是2009年1月7日提交的同名专利技术专利申请200980102076. 2的分案申请。 【相关申请信息】 本申请要求2008年1月7日提交的美国临时申请号61/010, 207的权利，并将其 整体纳入作为参考。 【背景】 某些具有潜在商业用途的蛋白质需要翻译后修饰，这些修饰可由哺乳动物细胞有 效产生。然而，哺乳动物细胞，如工业标准中国仓鼠细胞（CH0)，在GMP条件下难以生长，如 果繁殖至商业目的所需规模需要大量资源。基于动物的反应器系统因为其低成本、低维护 且易于规模化，是具有吸引力的基于CH0和其它哺乳动物细胞的系统的替代品。然而，治疗 性蛋白质的翻译后修饰，尤其是糖基化，与哺乳动物细胞如CH0细胞相比，在某些动物和植 物中执行方式不同。转基因禽类，部分因其高效产卵和产生蛋白质的能力，已成功用作治疗 性蛋白质的生物反应器。在一些例子中，发现与禽类如鸡的输卵管产生的并存储于卵的蛋 白质相连接的糖分子（即寡糖或糖基化结构）具有CH0和人类蛋白质相似的基本结构。然 而，输卵管中产生的某些蛋白质中并不出现某些结构性糖元件，这些结构性糖元件对于蛋 白质在病人中的生物反应性和生物利用度至关紧要。 当卵黄在输卵管（哺乳动物输卵管的禽类等价物）中行进时在其周围形成卵清。 输卵管中卵清形成的部分叫做输卵管膨大部（magnum)，由专门负责合成并分泌卵清蛋白质 的称作管状腺细胞（TGC)的细胞聚集而成。 蛋白质中的两类主要的糖基化结构，N-和0-连接的寡糖，由不同的酶的集合合 成。对于产蛋母鸡的输卵管膨大部产生并存储于卵清中的0-连接的寡糖（也称作0-聚 糖），寡糖产生所用的酶机器似乎与人〇-聚糖产生所用的类似，因为在人和禽类输卵管中 产生的寡糖结构中出现完全相同的糖和连接。 母鸡卵清N-连接寡糖（也称作N-聚糖）具有与人中那些某种程度相似的结构， 但通常缺少末端的半乳糖和唾液酸糖。对于某些治疗性蛋白，末端的半乳糖和唾液酸也许 对于病人中的生物利用度以及因此产生的效果至关紧要。 末端的唾液酸残基在母鸡输卵管产生的N-聚糖结构中很少出现或根本不出现， 它掩盖N-聚糖不被各种凝集素（识别糖分子的受体）识别。末端具有Gal的蛋白质可被 肝脏中表达的凝集素结合并从病人的血液循环中清除（Ashwell和Morell.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 41:99-128,1974)。具有含末端GlcNAc的N-聚糖的蛋白质，通常 如母鸡输卵管产生的蛋白质，或者含末端甘露糖的N-聚糖的蛋白质被巨嗜细胞上表达的 凝集素结合，并导致清除（Schlesinger等，Biochem J 192 :597-606，1980)。这些结果可导 致蛋白半衰期缩短，并降低效果。 有趣的时，鸡的其它器官中产生的N-聚糖，如血液中的那些，通常以Gal和 / 或唾液酸结尾（Ito 等，Rapid Commun Mass Spectrom 20 :3557_65, 2006 ;Raju 等， Glycobiology 10 :477-86.，2000)。因此显然鸡的基因组中包含合成完全唾液酸化N-聚糖 所需的酶的编码基因。 对于来自鸡卵清的N-聚糖，一小部分的侧链被Gal占据，这些Gal中的一小部分 带有唾液酸帽子。对于卵清〇-聚糖，绝大部分的侧链带有唾液酸帽子。在卵清蛋白质中 有相当数量的半乳糖和唾液酸，主要是因为〇-聚糖修饰的卵清蛋白质的丰度（Feeney等， J Biol Chem 235:2633-7,1960 ;Feeney等，J Biol Chem 235:2307-11，1960 ;Robinson和 Monsey. Biochem J 147 :55-62,1975)。N-和0-聚糖合成通路共享相同的Gal和唾液酸库 (Varki，等，《糖生物学纲要》(Essentials of Glycobiology)，纽约普莱恩维尤，冷泉港实验 室出版社（Plainview，NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)。因此在 TGC 中 用于聚糖合成的Gal和唾液酸水平很高，并不是限制因素。 卵清N-聚糖的结构以及已知有关哺乳动物中相关酶的信息提供了关于产生卵清 N-聚糖结构的细胞机制的线索。在哺乳动物中，N-聚糖合成开始于内质网中多萜醇寡糖前 体的合成，包括GlcNAc残基和多个甘露糖和葡萄糖残基。该复合物与靶蛋白的天冬酰胺相 连接。多种糖苷酶将前体修剪为3个甘露糖和2个GlcNac残基（称为核心五糖）。然后 糖苷转移酶将GlcNac、Gal和唾液酸残基依次加入。在此阶段N-聚糖结构的多样性变得明 显，可能是由于各种糖基转移酶的胞内水平以及糖基转移酶间对于生长的N-聚糖侧链上 自由接受位点的竞争（Varki，等《糖生物学纲要》（Essentials of Glycobiology)，纽约普 莱恩维尤，冷泉港实验室出版社（Plainview, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1999)〇 从GlcNac开始，至少有6种N-乙酰葡糖胺基转移酶（GnTs)负责将GlcNAc加入 到N-聚糖的三甘露糖基。卵清N-聚糖的高水平分支表明所有6种GnTs可在母鸡输卵管 细胞中某种程度表达。 半乳糖基转移酶（如，0 1，4半乳糖基转移酶），本文称为GalT，是一个具有至少 7个成员的家族，它们在N-和0-聚糖形成中扮有独特以及重叠的角色。GalTl(l型）被 认为负责将Gal加入到N-聚糖上所有连接的GlcNac残基中（Lee等，J Biol Chem 276: 13924-34, 2001)。该家族的其它成员，尤其是2型和3型，被认为能够催化这种转移，尽管 它们在N-聚糖合成中的实际作用看起来很小。GalTl在所有细胞类型中广泛表达，尽管水 平不同。 唾液酸转移酶（SialT)家族催化唾液酸加入到Gal或N-乙酰基半乳糖胺 (GalNac)(在0-连接聚糖的情况下）以及其它受体中。关于N-和0-聚糖，通过a 2, 3或 a 2, 6连接加入唾液酸，取决于所参与的具体SialT。人N-聚糖可具有a 2, 3和a 2, 6连 接之一或二者兼有。CH0-产生的N-聚糖仅具有a 2, 3连接，因为缺少a 2, 6SialT的表达 (Lee等，J Biol Chem 264 :13848-55,1989)。卵清N-聚糖和0-聚糖也似乎仅通过a 2, 3 连接进行连接。 a 2, 3SialT家族有6个成员。1和2型参与0-聚糖合成，因为它们使用Gal-GalNAc 链作为受体。3、4和6型显然将唾液酸加入到Gal-GlcNac链末端，可能参与N-聚糖和0-聚 糖合成。5型似乎不参与0-聚糖或N-聚糖合成，但是可能参与将唾液酸加入到含神经酰 胺的化合物中（Harduin-Lepers 等，Biochimie 83:727_37,2001)。除了在鸡胚中对于 1 型（SialTl)进行表达分析外，对于禽类a2,3SialT家族所知甚少（Kurosawa等，Biochim Biophys Acta 12本文档来自技高网...
【技术保护点】
转基因禽类，其具有含有半乳糖基转移酶编码序列的转基因，其中所述半乳糖基转移酶在转基因禽类的输卵管的管状腺细胞中表达，且其中所述半乳糖基转移酶在所述管状腺细胞中，向由在管状腺细胞中表达的其他转基因编码的外源性蛋白质的寡糖附加至少一个半乳糖，其中在不存在所述编码半乳糖基转移酶的转基因的情况下，所述寡糖不包含所述至少一个半乳糖。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·J·哈维，
申请(专利权)人：亚莱克逊药物有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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